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背景:缺血性中风作为常见的脑血管疾病之一,其发病率,致残率,致死率多年来也是居高不下,大多数在动物中风模型发现有效的神经保护剂在临床试验中都以失败告终。静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)是美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)唯一批准治疗急性缺血性中风的理想药物,但是,由于治疗窗狭窄(<4.5h)和具有再灌注损伤及后遗症恢复困难的缺点,其应用受到很大的限制。因此,开发有效的神经保护剂,从而减轻再灌注损伤,改善中风后遗症等成为当下迫在眉睫需要解决的问题。本课题组长期致力于防治缺血性中风和神经退行性疾病防治中药的研究,提出活血化瘀、通络醒脑的治疗原则,创立了由人参、制首乌和银杏叶组成的“乌参醒脑方”。为此,本研究主要围绕乌参醒脑方在治疗缺血性中风方面的作用及其作用机制进行研究。
目的:首先,在前人建立的方法学基础上,建立乌参醒脑方有效成分的指纹图谱和对其中有效成分进行含量测定以进行质量控制。在此基础上,建立体外OGD/R模型,探究乌参醒脑方对糖氧剥夺PC12细胞的神经保护作用及初步的作用机制。然后,建立大鼠大脑中动脉梗塞模型模拟体内缺血性中风状态,研究乌参醒脑方对缺血再灌注损伤的神经保护作用。最后,研究乌参醒脑方对缺血再灌注损伤的神经保护的作用机制,初步探究乌参醒脑方影响神经炎症与神经再生在缺血再灌注损伤之间的相互联系,为进一步新药开发研究打下基础。
方法:1.HPLC法建立乌参醒脑方的指纹图谱并对其中有效成分进行含量测定,建立体外OGD/R模型,运用CCK8法筛选出乌参醒脑方对PC12细胞的最佳给药浓度;利用PC12细胞制备OGD/R体外模型,通过CCK8法、LDH试剂盒、Elisa试剂盒等检测乌参醒脑方对糖氧剥夺PC12细胞的神经保护作用,初步探讨乌参醒脑方对糖氧剥夺PC12细胞的神经保护作用机制。2.在Longa等建立的大脑中动脉梗塞模型的基础上进行改良,利用从颈总动脉导入线栓到大脑前动脉的方法实验达到阻塞大脑中动脉血流的目的,通过TTC染色,神经行为学评分,水迷宫实验,尼氏染色等从体内探究乌参醒脑方对缺血再灌注损伤的神经保护作用。3.体外注射BrdU标记新生细胞,免疫荧光双标同时检测缺血再灌注损伤后大鼠脑内神经元再生的情况,WB检测TLR4/NF-κB通路关键蛋白TLR4,NF-κBp65,p-NF-κBp65,IκBα,p-IκBα表达情况,通过检测大鼠脑内新生的神经元数量和检测TLR4/NF-κB通路关键蛋白探究乌参醒脑方促进缺血再灌注损伤的神经再生作用和抑制TLR4/NF-κB炎症通路的作用机制。
结果:
1.建立乌参醒脑方有效成分的指纹图谱和对有效成分进行含量测定,此方法分离度良好,方法简便,重复性好。CCK8法筛选出乌参醒脑方的给药剂量为1,5,10μg/mL。此剂量下乌参醒脑方对PC12细胞的抑制率较小,细胞毒性低。乌参醒脑方对OGD/R后造成的PC12细胞损伤具有明显的保护作用,PC12的存活率大大提高。乌参醒脑方对OGD/R后造成的PC12细胞LDH泄漏量的影响呈现降低的趋势,对OGD/R致PC12损伤具有一定的保护作用。乌参醒脑方可以通过抑制促炎因子IL-1β的释放,促进抑炎因子IL-10的产生来保护因OGD/R受损的神经细胞。
2.TTC染色和神经功能行为评分显示已成功建立大脑中动脉梗塞模型,乌参醒脑方给药14天后,缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺陷得到进一步的改善;水迷宫的定位航行和空间搜索结果显示乌参醒脑方对缺血再灌注损伤大鼠的学习记忆能力缺陷有改善作用。尼氏染色结果显示乌参醒脑给药后缺血再灌注损伤大鼠海马区CA1、CA3区神经损伤明显减轻,神经细胞排列整齐,核仁清楚,尼氏小体数量增加。
3.免疫荧光结果显示乌参醒脑方给药14天后,可以促进缺血再灌注损伤大鼠内源性神经元再生,且呈剂量依赖性。WB结果显示乌参醒脑方给药后,TLR4、p-IκBα/IκBα、p-NF-κBp65/NF-κBp65蛋白表达水平相比于模型组显著降低,且具有统计学意义。表明乌参醒脑方可能是通过阻断TLR4/NF-κB信号通路的活化对缺血性中风大鼠发挥神经保护的作用。
结论:体外实验中,乌参醒脑方对糖氧剥夺损伤的PC12细胞具有神经保护作用;体内实验中,乌参醒脑方对缺血再灌注损伤大鼠具有提高学习记忆能力,改善神经功能缺陷,保护神经元的作用,并且该作用可能与促进大脑内源性神经元再生和抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。本文的研究结果可能为乌参醒脑方新药的研发及往后的临床试验奠定了一个药效学基础,对于缺血性中风的药物的开发具有重要的参考意义。
目的:首先,在前人建立的方法学基础上,建立乌参醒脑方有效成分的指纹图谱和对其中有效成分进行含量测定以进行质量控制。在此基础上,建立体外OGD/R模型,探究乌参醒脑方对糖氧剥夺PC12细胞的神经保护作用及初步的作用机制。然后,建立大鼠大脑中动脉梗塞模型模拟体内缺血性中风状态,研究乌参醒脑方对缺血再灌注损伤的神经保护作用。最后,研究乌参醒脑方对缺血再灌注损伤的神经保护的作用机制,初步探究乌参醒脑方影响神经炎症与神经再生在缺血再灌注损伤之间的相互联系,为进一步新药开发研究打下基础。
方法:1.HPLC法建立乌参醒脑方的指纹图谱并对其中有效成分进行含量测定,建立体外OGD/R模型,运用CCK8法筛选出乌参醒脑方对PC12细胞的最佳给药浓度;利用PC12细胞制备OGD/R体外模型,通过CCK8法、LDH试剂盒、Elisa试剂盒等检测乌参醒脑方对糖氧剥夺PC12细胞的神经保护作用,初步探讨乌参醒脑方对糖氧剥夺PC12细胞的神经保护作用机制。2.在Longa等建立的大脑中动脉梗塞模型的基础上进行改良,利用从颈总动脉导入线栓到大脑前动脉的方法实验达到阻塞大脑中动脉血流的目的,通过TTC染色,神经行为学评分,水迷宫实验,尼氏染色等从体内探究乌参醒脑方对缺血再灌注损伤的神经保护作用。3.体外注射BrdU标记新生细胞,免疫荧光双标同时检测缺血再灌注损伤后大鼠脑内神经元再生的情况,WB检测TLR4/NF-κB通路关键蛋白TLR4,NF-κBp65,p-NF-κBp65,IκBα,p-IκBα表达情况,通过检测大鼠脑内新生的神经元数量和检测TLR4/NF-κB通路关键蛋白探究乌参醒脑方促进缺血再灌注损伤的神经再生作用和抑制TLR4/NF-κB炎症通路的作用机制。
结果:
1.建立乌参醒脑方有效成分的指纹图谱和对有效成分进行含量测定,此方法分离度良好,方法简便,重复性好。CCK8法筛选出乌参醒脑方的给药剂量为1,5,10μg/mL。此剂量下乌参醒脑方对PC12细胞的抑制率较小,细胞毒性低。乌参醒脑方对OGD/R后造成的PC12细胞损伤具有明显的保护作用,PC12的存活率大大提高。乌参醒脑方对OGD/R后造成的PC12细胞LDH泄漏量的影响呈现降低的趋势,对OGD/R致PC12损伤具有一定的保护作用。乌参醒脑方可以通过抑制促炎因子IL-1β的释放,促进抑炎因子IL-10的产生来保护因OGD/R受损的神经细胞。
2.TTC染色和神经功能行为评分显示已成功建立大脑中动脉梗塞模型,乌参醒脑方给药14天后,缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺陷得到进一步的改善;水迷宫的定位航行和空间搜索结果显示乌参醒脑方对缺血再灌注损伤大鼠的学习记忆能力缺陷有改善作用。尼氏染色结果显示乌参醒脑给药后缺血再灌注损伤大鼠海马区CA1、CA3区神经损伤明显减轻,神经细胞排列整齐,核仁清楚,尼氏小体数量增加。
3.免疫荧光结果显示乌参醒脑方给药14天后,可以促进缺血再灌注损伤大鼠内源性神经元再生,且呈剂量依赖性。WB结果显示乌参醒脑方给药后,TLR4、p-IκBα/IκBα、p-NF-κBp65/NF-κBp65蛋白表达水平相比于模型组显著降低,且具有统计学意义。表明乌参醒脑方可能是通过阻断TLR4/NF-κB信号通路的活化对缺血性中风大鼠发挥神经保护的作用。
结论:体外实验中,乌参醒脑方对糖氧剥夺损伤的PC12细胞具有神经保护作用;体内实验中,乌参醒脑方对缺血再灌注损伤大鼠具有提高学习记忆能力,改善神经功能缺陷,保护神经元的作用,并且该作用可能与促进大脑内源性神经元再生和抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。本文的研究结果可能为乌参醒脑方新药的研发及往后的临床试验奠定了一个药效学基础,对于缺血性中风的药物的开发具有重要的参考意义。