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自然界中存在各种各样的氧化还原酶,它们在生命体中发挥着不同的作用。其中甲酸脱氢酶（FDH）是以NAD+作为辅酶催化甲酸盐生成二氧化碳同时生成辅酶NADH的氧化还原酶。其不仅广泛应用于多种工业产品酶法生产体系中辅酶的再生,而且对其改造后能够进行逆反应将二氧化碳催化为甲酸盐,为解决全球温室效应提供新的思路。当前常用的如X-ray、冷冻电镜和动力学模拟计算等研究手段能够解析反应过程可能存在的构象变化和能量跃迁过程,但是这些方法仍然无法实时地检测酶的动态催化过程。而且,群体水平酶反应过程测量所得的平均值掩盖了其真正的催化行为,无法真实地展示氧化还原酶催化过程的状态变化。单分子技术如纳米孔、光镊、单分子原子力学显微镜和扫描遂穿裂结（Scanning Tunneling Microscope Break-Junction,STM-BJ）等测试方法的发展为生物大分子变化过程的动态监测提供了可能。本论文成功建立了基于STM-BJ的单分子测试平台,并利用该平台测试了NAD+与FDH的相互作用,揭示了单分子尺度下FDH催化反应的机理。主要研究内容和结果如下:第一,建立了单分子尺度甲酸脱氢酶电学测试平台。研究了甲酸脱氢酶的相关酶学性质和动力学参数,确定甲酸脱氢酶最适的催化条件和催化反应时间。优化了 STM-BJ应用于单分子酶体系的测试方法,对针尖进行刻蚀和包封以用于极性溶剂体系的电学测试。单分子电学测试结果显示FDH的电导值为10^-4.28 G0,证明我们成功的构建了用于单分子酶电学测试平台。同时为了进一步验证酶与针尖和基底的连接位点,对甲酸脱氢酶进行定点突变,将23位半胱氨酸突变成丝氨酸,使得FDH与Au针尖和基底相互作用的位点发生改变难以形成共价键。研究结果显示突变后FDH的电导测试数据均为遂穿电流信号（无任何分子电导信号）,说明表面的半胱氨酸在氧化还原酶的STM-BJ测试过程中是必不可少的,甲酸脱氢酶携带的两个半胱氨酸可以作为金属结合位点形成Au-分子-Au的分子结。至此,本章通过STM-BJ实现对氧化还原酶的单分子电导测试,为后续进一步研究构筑了一个稳定的平台,奠定了良好的基础。第二,考察辅酶NAD+和FDH的结合并形成FDH-NAD+复合体后,电子传递的变化规律,验证NAD+的添加能够一定程度提高酶的电导值。首先在FDH测试体系中添加过量NAD+溶液（摩尔比1:11428571）,发现添加NAD+后,FDH的电导值提升到10^-2.88 G0,相比于FDH的电导值提升了 21倍。然而,NAD+既可能通过电荷吸附在FDH的表面,也可能与活性空腔的氨基酸结合形成二元复合体,因此选择辅酶NADP+作为对照,其因为位阻效应无法结合到酶的活性中心。添加同样比例的NADP+后FDH的电导值为10^-3.93 G0,并没有出现显著的提升,证明NAD+主要通过与FDH的辅酶结合位点相互作用引起电导值的显著提升。在此基础上分别考察了不同NAD+浓度（1:67227,1:571429,1:2285714和1:11428571）和不同 pH 环境（3.5、6.5、8.5、10.5 和 12.5）下 FDH-NAD+的电子传递情况,结合酶催化活性证明NAD+的浓度同时影响酶的催化速率和电子传递速率。第三,基于辅酶和FDH的单分子电子学性质表征结果,进一步考察NAD+对FDH电子传递速率的影响规律。首先通过密度泛函理论（DFT）计算了 FDH和FDH-NAD+两种状态的HOMO和LUMO,计算结果表明NAD+的添加不仅能够改变FDH上HOMO和LUMO的分布,而且相比于FDH,FDH-NAD+的HOMO-LUMO gap从5.74eV缩小到3.22eV,可见借助NAD+更有助于电子的传递。基于理论计算的结果,我们进一步通过电导闪烁噪声实验验证了 NAD+的添加能够使得电子的传递模式从FDH中的through-space向FDH-NAD+中的through-bond转变,说明NAD+的结合改变了 FDH-NAD+二元复合体中电子的传输路径并引起了电导的提升。因此对NAD+与FDH结合的三个关键氨基酸D282、R174和Y194进行突变,并考察突变后FDH的电子学和酶学性质,结合动力学模拟计算突变体和原始FDH与NAD+结合能的变化,发现改变FDH与NAD+结合的氢键作用力可以同时影响酶的活性和电导值,并且酶活、电导和结合能三者之间呈现正相关关系。因此,本章研究结果表明FDH-NAD+中FDH与NAD+的氢键作用是其电导值显著提升的主要原因,并且氢键在酶的催化反应和电子传递过程中都发挥着至关重要的作用。第四,通过裂结和悬停两种单分子电学测试模式监测FDH的催化反过程。前三章的研究已经揭示了 FDH和FDH-NAD+在电导值上存在显著差异,因此本章利用FDH、FDH-NAD+以及FDH-NADH和FDH-HCO2-的电导值作为内标去研究FDH的动态催化过程。首先通过裂结的模式标定FDH催化过程出现的部分稳态的电导值,确定了 FDH-NAD+、FDH-NADH、FDH和FDH-HCO2-四种稳态的电导值分别为10^-2.68 G0、10^-3.04G0、10^-4.38G0和10^-4.45 G0,并且发现不同于辅酶NAD+,底物甲酸盐并不会引起FDH电导值发生变化。然后进一步监测FDH的催化反应,结果显示无论是反应过程中辅酶逐渐过量还是底物逐渐过量,均能够测试到五种瞬态状态的电导（依照电导值的大小命名为T1、T2、T3、T4和T5）,其中T1、T2和T5分别对应FDH-NAD、FDH-NADH和FDH,推测T3和T4可能是反应过程中捕获到反应中间态（FDH-NAD+-HCO2-和FDH-NADH-CO2）。因此,借助裂结模式能够成功捕获到FDH反应过程的中间状态,但因非连续的测试模式缺失了时间参数,无法获得连续的催化循环。于是采用悬停模式对FDH的催化反应进行进一步研究,借助MATLAB等数据处理软件对悬停测试的数据进行聚类和分析,结果表明悬停模式也能同样捕获到五种电导状态。具有时间顺序的催化循环过程分析结果表明,未监测到Theorell-Chance机理中的催化反应顺序（T2-T5-T1-T3-T4）,而检测到的新反应顺序（T2-T1-T3-T4）是单分子尺度下FDH催化过程的主要反应顺序。具体地说,反应末期NADH不从FDH的空腔中脱离并结合新的NAD+,而是转变成NAD+直接形成FDH-NAD+复合体。除此之外,测到的电导数据中存在T1-T2-T1-T2和T3-T4-T3-T4的反复转化数据,结合QM/MM计算结果显示,FDH催化过程中的确存在T1-T2和T3-T4的可逆转化。相比于NADH从FDH活性空腔脱离的过程,反应结束时NADH能够通过调整构型使得NAD+进入反应空腔,实现近距离的氢负离子交换需要的能垒更低。