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骨形态发生蛋白 6(Bone Morphogenetic Protein 6,BMP6)属于 BMPs 蛋白家族中的一员,是一种分泌型多功能蛋白,已有研究表明BMP6在哺乳类动物卵巢中表达并且能够调控卵泡类固醇激素的合成,但是在不同物种间存在着差异性。因此在这些发现的基础上,本试验以鸡卵泡为研究对象,研究BMP6在鸡卵泡中的表达及功能。首先利用荧光定量PCR和Western blot分析了 BMP6在鸡不同阶段卵泡中mRNA和蛋白的表达水平;在鸡卵泡颗粒细胞体外培养过程中,设置不同浓度的蛋白梯度,用CCK-8法分析颗粒细胞的增殖情况;用荧光定量PCR和Western blot分别检测孕酮合成中的关键基因StAR和3β-HSD在不同浓度BMP6蛋白处理组中的表达变化情况;分离培养鸡产蛋期的颗粒细胞,添加不同浓度的BMP6蛋白和FSH处理,后采用Elisa测定颗粒细胞上清中孕酮的分泌量。由上述一系列试验我们得出以下主要结果:(1)利用荧光定量PCR分析BMP6mRNA在鸡不同阶段卵泡中的表达水平,发现BMP6在各个阶段卵泡中均有表达,且在等级卵泡中的表达量随卵泡的增大而增加,在F1中的表达量达到最高,显著高于其在等级卵泡F2、F3、F4和F5中的表达量(P<0.05),而在F4和F5卵泡中的表达量差异不显著(P>0.05)。就等级前卵泡来说,BMP6基因在LWF中的表达量显著高于SYF(P<0.05),但与SWF中的表达量差异不显著(P>0.05)。随后利用Western blot分析BMP6蛋白在鸡不同阶段卵泡中的表达水平,发现BMP6在卵泡上的蛋白表达水平与BMP6 mRNA类似,也是在在各个阶段卵泡中均有表达,且在F1卵泡中的表达量显著高于其他时期卵泡。以上结果表明,BMP6的表达量与卵泡发育相关,推测BMP6可能参与调节鸡卵泡的发育。(2)在鸡卵泡颗粒细胞体外培养过程中,设置4个不同浓度的蛋白梯度,分别为 Ong/ml、25ng/ml、50ng/ml 及 100ng/ml,体外培养 48h 后,用 CCK-8 法分析颗粒细胞的增殖情况。添加25ng/ml BMP6蛋白的实验组与空白对照组相比,颗粒细胞数目无明显变化(P>0.05),但添加50ng/ml和l00ng/ml蛋白的实验组与空白对照组相比,颗粒细胞数目显著增加(P<0.05),提示BMP6蛋白在体外能够促进鸡颗粒细胞的增殖。(3)为研究BMP6蛋白在鸡颗粒细胞体外培养过程中对孕酮合成的影响,选择StAR和3β-HSD这两个孕酮合成中的关键蛋白,用实时定量PCR和Western blot在mRNA水平和蛋白水平检测BMP6是否影响StAR和3β-HSD基因的表达。实验结果表明,外源的BMP6能够在mRNA水平和蛋白水平上显著促进鸡颗粒细胞StAR及3β-HSD基因的表达,并且随着BMP6浓度的增加,这种促进作用也不断加强,提示BMP6能够以剂量依赖的方式调节StAR和3β-HSD基因的表达,由于StAR和3β-HSD是孕酮合成过程中的两个关键蛋白,因此我们推测BMP6能够促进鸡卵泡颗粒细胞中孕酮的合成。(4)分离培养鸡产蛋期的卵泡颗粒细胞,并添加不同浓度的BMP6蛋白和FSH处理,采用Elisa测定颗粒细胞上清中孕酮的分泌量,结果显示,添加BMP6蛋白的颗粒细胞中孕酮的分泌量显著高于不添加BMP6蛋白的颗粒细胞(P<0.05),且孕酮的分泌量随着BMP6添加浓度的升高而显著升高(P<0.05)。单独添加BMP6蛋白和FSH激素的颗粒细胞的孕酮分泌量显著高于空白培养基的孕酮分泌量(P<0.05),且BMP6蛋白和FSH激素都添加的情况下,孕酮的分泌量最高。综上所述,BMP6无论在mRNA水平还是蛋白水平上,都展现出能够促进卵泡发育的能力,同时对卵泡颗粒细胞增殖和孕酮的合成也有不同程度的调控作用。