现代组织工程学是近几年迅猛发展的新学科,其将对组织器官的修复与替代产生划时代意义。组织工程技术大致由四大要素组成:自体种子细胞的获得;种子细胞的生长与分化;种有细胞的载体移入体内;移植物与受区整合,组织形成。其中组织细胞的获得、培养与分化是此工程的前提和基础。目前多应用自体或异体成熟细胞如软骨细胞、脂肪细胞为种子细胞,但由于其体外扩增能力弱,难以获得足够的数量,且取材对供区造成的损失也较重。因此,人们开始寻找具有强大的体外增殖力和多向系分化的干细胞,现已成功获得骨髓间充质干细胞,并证明其能向多种中胚层组织细胞分化,但骨髓的抽取往往给患者造成痛苦,且来源有限,每个成人只能抽取10～20 ml骨髓,所以其广泛应用受到限制。近年有学者注意到,在某些病理情况下脂肪中有异位骨形成,这表明脂肪组织中可能存在某些细胞可分化为其他组织细胞。脂肪组织抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增,且肥胖人群也越来越多,许多人主动要求抽吸脂肪,所以容易大量获得,对供区的损伤也小,这就使其成为组织工程研究的种子细胞又一研究热点。本实验就是通过对其生物学特性、多向分化的潜能以及在支架中培养分化的性能进行研究,以探讨脂肪干细胞是否可作为骨组织工程的种子细胞。第一部分兔脂肪间充质干细胞分离、培养及生物学特性的实验研究【目的】掌握兔脂肪间充质干细胞的分离、培养和扩增的方法,并探讨其部分生物学特性。【方法】无菌条件下窃取兔双侧腹股沟脂肪垫,加入适量Ⅰ型胶原酶消化获取细胞,接种入含10%血清的DMEM培养基,倒置显微镜下连续观察细胞形态变化。取传代细胞用免疫细胞化学检测表面抗原标志CD34、CD44。MTT法测定第2、5、10代细胞的生长曲线。并测定细胞的贴壁率。【结果】原代培养显示原代细胞3天左右开始贴壁,呈梭形纤维样细胞形态,8天左右可达90%融合,呈漩涡状排列,形成集落。传代后2～4h开始贴壁,经过较短的潜伏期后开始增殖,3d即可长满。10代以后细胞传代后潜伏期延长,细胞增殖速度逐渐减慢。免疫细胞化学检测显示细胞表达表面MSCs表面抗原标志CD44,而不表达造血干细胞表面标志CD34。生长曲线显示第2、5代兔ADSCs细胞增殖能力较强,以第5代细胞为甚,第10代细胞增殖能力减弱。2、6、12h贴壁率分别为33%、75%、90%。【结论】从兔脂肪中分离的细胞具有间充质干细胞的特性,能长期培养,生长稳定、增殖较快,可以作为组织工程的种子细胞。第二部分兔脂肪间充质干细胞的体外诱导分化的研究【目的】研究脂肪问充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADMSCs)分离培养及诱导分化的方法,探讨兔ADSCs在体外向成骨细胞、软骨细胞分化的能力。【方法】从兔腹股沟处无菌获取脂肪组织,胶原酶消化分离,培养出ADSCs。基础培养基传至第三代时改换为诱导培养基,分别诱导向成骨、软骨细胞分化,培养2～4周,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Von kossa染色鉴定向成骨细胞分化能力;甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原染色鉴定向软骨细胞分化能力。【结果】兔脂肪能够分离培养出生长旺盛的ADSCs;并向成骨细胞诱导,ALP、Von kossa染色阳性;向软骨细胞诱导,甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原染色阳性。【结论】兔脂肪组织可以分离培养出的ADSCs,能够向成骨细胞、软骨细胞分化,有希望成为组织工程理想的种子细胞来源。第三部分兔脂肪间充质干细胞复合纤维蛋白胶/透明质酸支架成软骨分化的实验研究【目的】探讨兔脂肪ADSCs在纤维蛋白胶/透明质酸三维支架上培养、定向诱导分化成软骨的能力。【方法】按照第一章实验方法分离培养细胞。取第3代细胞,以1×10~7/ml的细胞密度接种于纤维蛋白胶/透明质酸支架上,加入诱导培养基定向诱导培养,即10%新生牛血清+1ng/mL的TGF-β1+6.25ug/mL转铁蛋白+6.25ug/mL胰岛素+0.1nmol/mL地塞米松。于培养3周时将支架制备成石蜡切片分别进行HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色。并对支架进行电镜扫描。【结果】培养至两周左右,在倒置显微镜下于不同层面均可见大量圆形的细胞样结构。HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原染色均成阳性。电镜扫描可见细胞分散在材料孔隙内,细胞形态为圆形或类圆形。【结论】兔ADSCs接种在纤维蛋白胶/透明质酸支架,经过成软骨诱导分化后,形成了具有部分软骨组织特性的物质。