论文部分内容阅读
目的:本研究选取苦参碱衍生物MASM,体外评价其对星形胶质细胞(astrocytes,AST)活化的影响;体内采用实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型评价MASM对EAE的作用,并探讨其作用机制,为其临床应用提供实验依据。方法:(1)小鼠原代星形胶质细胞的培养和鉴定:3天内新生小鼠的脑,经0.25%胰酶和1%DNase I消化后,过滤,离心,弃上清,细胞重悬接种于多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中,置37℃、5%CO2培养箱中培养,每隔3至4天换液,纯化,细胞最后融合成单层,并采用Real-Time PCR和免疫荧光技术对这些细胞进行纯度鉴定。(2)细胞毒性采用细胞计数试剂盒-8(Cell counting Kit-8,CCK-8)法检测AST活力,以确定MASM的作用浓度范围;(3)将AST分为以下几个组:空白组(Control组)、模型组(LPS组)、5μM MASM给药组、10μM MASM给药组、20μM MASM给药组,除Control组不加任何刺激剂之外,其余四组均同时采用100ng/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导AST活化;(4)Real-Time PCR检测LPS诱导AST释放细胞因子白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)以及诱导型一氧化氮合酶的影响(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)、抑炎因子白介素-10(Interleukin-10,IL-10)m RNA水平;(5)采用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法和Griess法分别检测细胞上清中TNF-α和一氧化氮(Nitric oxide,NO)的含量;(6)采用Boyden小室测定星形胶质细胞条件培养基对单核巨噬细胞的迁移作用;(7)Real-Time PCR检测A1型星形胶质细胞的标志基因H2-T23、H2-D1、Serping1 m RNA水平;(8)采用荧光Aβ42吞噬实验检测AST吞噬能力的变化;(9)Real-Time PCR检测AST吞噬受体Mertk、Megf10和Ax1的m RNA水平;(10)Real-Time PCR检测AST突触因子Thbs1、Sparcl1、Gpc4、Gpc6的m RNA水平;(11)采用MOG35-55诱导的小鼠EAE模型:小鼠脊柱两侧皮下4点注射MOG35-55制成的完全培养基,第0天和第1天鼠尾静脉注射百日咳毒素,第8天开始每日采用MASM(3mg/kg)灌胃给药直至实验结束;同时进行每日评分和体重记录;(12)苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)检查小鼠脊髓组织病理学变化;(13)劳克坚劳蓝染色(Luxol Fast Blue,LFB)观察脊髓组织中脱髓鞘变化。(14)Bioeischowsky镀银染色检测脊髓组织中轴突丧失的情况;(15)Real-Time PCR检测脑和脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、MCP-1和i NOS m RNA水平;(16)采用免疫组化检测脑和脊髓中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达水平;(17)蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测脊髓和脑组织中GFAP蛋白质表达水平;(18)组织免疫荧光检测脊髓组织中水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)表达;(19)免疫荧光双染检测脊髓和脑组织中半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3,C3)和GFAP的表达水平;(20)Western blot检测AST中P65、p-P65、STAT3、P-STAT3表达;(21)免疫组化检测脊髓中p-P65和P-STAT3。结果:1、MASM抑制LPS诱导的星形胶质细胞炎症反应:MASM显著能降低LPS诱导的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、MCP-1和i NOS m RNA水平升高(P<0.05或0.01);MASM能浓度依赖地减少AST释放TNF-α和NO(P<0.05或0.01);MASM减弱ACM对RAW246.7细胞的迁移作用(P<0.05或0.01);2、MASM抑制AST分化:MASM能抑制LPS、TNF-α、IL-1α、TNF-α和IL-1α联合使用诱导的A1型星形胶质细胞的标志基因H2-T23、H2-D1、Serping1 m RNA水平上升(P<0.05或0.01);3、MASM改善AST受损的吞噬和促突触形成功能:MASM可以浓度依赖的改善AST的吞噬能力的损伤;MASM浓度依赖性的恢复LPS降低的Mertk、Megf10和Axl m RNA水平(P<0.05或0.01);MASM能浓度依赖地增加活化的AST下降的Thbs1、Sparcl1、Gpc4和Gpc6 m RNA水平(P<0.05或0.01);4、MASM(3 mg/kg)能够有效改善EAE的病情进展:MASM改善临床评分和体重减轻(P<0.05或0.01);MASM减少EAE小鼠的炎症细胞的浸润、脊髓脱髓鞘、轴突丧失的情况;MASM降低EAE小鼠脑和脊髓中炎症介质的m RNA水平(P<0.05或0.01);5、MASM(3 mg/kg)能抑制AST活化,改善血脑屏障功能:减少EAE小鼠脑和脊髓中棕黄色GFAP阳性细胞;16、MASM减少EAE小鼠脑和脊髓中GFAP蛋白表达水平(P<0.05或0.01);MASM减少EAE小鼠AQP4蛋白的表达(P<0.05或0.01);MASM减少了EAE小鼠的A1型星形胶质细胞数量;6、MASM能抑制NF-κB和STAT3的磷酸化:MASM在细胞水平上抑制了P-65和STAT3的磷酸化水平的增加(P<0.05或0.01);MASM在EAE小鼠脊髓中抑制了p-P65和P-STAT3的表达;结论:MASM能抑制AST的活化,减少细胞因子的释放,抑制A1型星形胶质细胞的转化,增加突触形成因子以及吞噬受体的表达,恢复AST受损的吞噬能力。MASM抑制EAE的炎症反应、减轻脱髓鞘和轴突丢失以及改善EAE后肢瘫痪等症状。MASM可能是通过抑制NF-κB通路和AST活化,阻止A1形成,从而抑制髓鞘脱失或促进髓鞘再生,达到改善EAE的作用。