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子宫内膜异位症(内异症)是严重威胁育龄期女性生殖健康的妇科常见病之一,其虽是良性疾病,却具有侵袭和播散的恶性行为,成为目前少有的几种妇科顽症之一。近年来研究表明,免疫细胞功能的变化及免疫调节异常,可参与异位症的发生发展。在病理条件下,髓系来源的抑制细胞(MDSCs)在病变微环境中募集活化,通过负向调节免疫效应,参与多种疾病(如膀胱癌、败血症)发生发展。本研究通过检测CD11b和ARG-1两种分子在内异症患者,异位内膜和在位内膜中的表达,MDSCs在内异症患者外周血单个核细胞和腹腔腹腔淋巴细胞中的比例,并与正常或其他女性生殖系统良性疾病患者(子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤)相对比,发现MDSCs在内异症患者腹腔液淋巴细胞及外周血单个核细胞中比例异常升高,且发现单核系髓系来源的抑制细胞(M-MDSCs)是主要类型的MDSCs。内异症中M-MDSCs主要由CCR9/CCL25和CCL5/CCR1募集,M-MDSCs共同表达CCR1和CCR9,其表达水平不受GM-CSF影响。M-MDSCs可通过精氨酸酶-1和诱导型一氧化氮合酶抑制CD8+T细胞增殖,也可抑制巨噬细胞的吞噬功能;且CCL25可促进M-MDSCs分泌IL-10和GM-CSF,而GM-CSF可进一步促进M-MDSCs的增殖。内异症患者腹腔液也可促进M-MDSCs的增殖,CCL5和CCL25可增强M-MDSCs中精氨酸酶-1的活性。内异症患者腹腔液中淋巴细胞和外周血单个核细胞中精氨酸酶-1活性明显高于其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤)患者。因此,我们认为由CCR9/CCL25募集并激活的CD14+CD33+HLADR-M-MDSCs可促进内异症的发生发展。本研究将从免疫学角度,进一步揭示内异症的发病机制,为内异症的治疗提供依据。第一部分M-MDSCs在内异症患者中的异常聚集目的:M-MDSCs在内异症患者中的聚集情况。方法:分别收集内异症患者的异位内膜、在位内膜、腹腔液、外周血,其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤)患者的正常内膜、腹腔液、外周血,和正常人的外周血等组织标本,通过免疫组化技术、Real Time-PCR技术检测CD11b和ARG1两种分子在内异症患者、子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤患者正常内膜组织中的表达,流式细胞术分别检测MDSCs、M-MDSCs在内异症患者、子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤患者腹腔液淋巴细胞以及内异症患者、子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤患者和正常人外周血单个核细胞中的比例。分别在GM-CSF刺激外周血单个核细胞或腹腔液淋巴细胞48小时前后,流式细胞术检测M-MDSCs的比例。流式细胞术检测通过HLADR磁珠阴选,后经CD11b磁珠阳选的外周血单个核细胞和腹腔淋巴细胞,初步得到的M-MDSCs的纯度,并将其使用GM-CSF刺激48小时后,再次检测M-MDSCs的纯度。结果:(1)免疫组化和Real Time-PCR结果提示,与其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤)患者相比,CD11b和ARG1两种分子在内异症患者异位内膜和在位内膜组织中的表达明显升高,且这两种分子主要表达于细胞质中。(2)流式细胞术结果显示,内异症患者外周血单个核细胞中MDSCs比例高于正常,也高于其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤)患者;内异症患者腹腔液淋巴细胞中MDSCs比例高于其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤)患者;并且在外周血及腹腔液CD11b+CD33+HLADRM-MDSCs是MDSCs的主要类型。(3)流式细胞术结果显示,GM-CSF可促进内异症患者外周血单个核细胞和腹腔液淋巴细胞中M-MDSCs的增殖,还可显著提高经磁珠分选外周血单个核细胞或腹腔淋巴细胞得到的M-MDSCs的纯度。结论:MDSCs在内异症患者体内异常聚集,其中CD11b+CD33+HLRDR-M-MDSCs是主要类型。第二部分CD14+CD33+HLADR-M-MDSCs的募集及功能目的:研究M-MDSCs的募集及其对T细胞、巨噬细胞的影响。方法:酶联免疫吸附试验检测内异症患者和其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤)患者腹腔液中CCL5、CCL25的浓度。流式细胞术分别检测磁珠分选得到的M-MDSCs,然后经GM-CSF扩增48小时前后,M-MDSCs表面CCR1和CCR9的表达水平。Transwell实验,检测M-MDSCs对两种趋化因子(CCL5、CCL25)及其受体中和性抗体和两种趋化因子的中和性抗体的趋化效应,1小时后倒置显微镜下计数,对比迁移至下层小室中的细胞数。磁珠分选后,经过GM-CSF扩增获得的M-MDSCs与抗CD3/CD28抗体激活的CD8+T细胞以不同比例(1:1,1:5,1:10)直接共培养,并在培养体系中加入诱导型一氧化氮合酶或精氨酸酶抑制剂,72小时后,3H-胸腺嘧啶核苷渗入法检测CD8+T细胞增殖情况;佛波酯诱导巨噬细胞系,然后与磁珠分选后,经过GM-CSF扩增获得的M-MDSCs以1:1的比例直接共培养,6小时后流式细胞术检测巨噬细胞的吞噬情况。结果:(1)酶联免疫吸附试验结果提示,内异症患者比其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤和卵巢畸胎瘤)患者腹腔液中含更高浓度的CCL5和CCL25分子。(2)M-MDSCs同时高表达CCR1和CCR9两种分子,且CCR9分子高于CCR1分子的表达;GM-CSF不影响M-MDSCs表面CCR1和CCR9分子的表达水平。(3)M-MDSCs主要由CCR9/CCL25和CCL5/CCR1募集,该募集作用可被该两种趋化因子受体的中和性抗体或两种趋化因子的中和性抗体部分抑制。(4)3H-胸腺嘧啶核苷渗入法结果显示,M-MDSCs可通过诱导型一氧化氮合酶或精氨酸酶-1明显抑制CD8+T细胞的增殖。(5)流式细胞术结果显示,M-MDSCs可明显抑制巨噬细胞的吞噬功能。结论:CCR9/CCL25和CCL5/CCR1募集的M-MDSCs可抑制CD8+T细胞增殖和巨噬细胞的吞噬作用。第三部分内异症微环境对M-MDSCs的调控作用目的:研究内异症微环境对M-MDSCs的影响。方法:酶联免疫吸附试验检测内异症患者和其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤、卵巢畸胎瘤)患者腹腔液中IL-10分子的浓度;rh CCL25、CCR9中和性抗体或CCL25中和性抗体分别处理磁珠分选并用GM-CSF扩增48小时的M-MDSCs,48小时后,酶联免疫吸附试验检测培养液上清中IL-10和GM-SCF分子的浓度。使用CFSE标记磁珠分选并用GM-CSF扩增48小时的M-MDSCs,使用内异症患者腹腔液或GM-CSF刺激M-MDSCs 48小时,流式细胞术检测M-MDSCs的增殖。分别检测内异症患者外周血单个核细胞、腹腔液,或其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤、卵巢畸胎瘤)患者腹腔液精氨酸酶的活性;分别检测rh CCL5或rh CCL25或rh CCL25同时加入CCR9中和性抗体处理的M-MDSCs 48小时后,精氨酸酶的活性。结果:(1)酶联免疫吸附试验结果显示,内异症患者比其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤、卵巢畸胎瘤)患者腹腔液中含更高浓度的IL-10分子。CCL25可与CCR9结合,促进M-MDSCs分泌IL-10和GM-CSF分子。(2)流式细胞术结果显示,内异症患者腹腔液可明显促进M-MDSCs增殖。(3)精氨酸酶活性实验结果显示,内异症患者腹腔液精氨酸酶活性高于内异症患者外周血单个核细胞,也高于其他女性生殖系统良性疾病(子宫平滑肌瘤、卵巢畸胎瘤)患者腹腔液;rh CCL5、rh CCL25可明显提高M-MDSCs中精氨酸酶活性。结论:内异症患者腹腔微环境可正向促进M-MDSCs的增殖、精氨酸酶活性及细胞因子IL-10和GM-CSF的分泌。