医圣张仲景创立五苓散,首载于《伤寒论》,原文记载：“猪苓十八铢、去皮,泽泻一两六铢,白术十八铢,茯苓十八铢,桂枝半两、去皮,上五味,捣为散,以白饮和服方寸匕,日三服。多饮暖水,汗出愈。如法将息”。由此可见原文要求以散剂应用,而在现代临床实际应用中,五苓方虽然也都称作五苓散,但实际上均已采用五苓方的汤剂。然而,到目前为止,并未检索到任何能够证明五苓方散剂与五苓方汤剂临床疗效相当的文献报道。众多散在的临床研究显示,些经典散剂以远低于其同方汤剂的剂量应用,结果散剂的临床疗效远优于其同方汤剂。如有文献报道了41例五苓方同方汤、散剂治疗水湿内停证患者的随机对照临床研究,其中散剂组给予按原方比例制备的五苓方散剂,每次9 g,每日3次,疗程四周；汤剂组由茯苓18g、泽泻30g、猪苓18 g、桂枝12 g、白术18g组成,水煎服,每日一剂,分两次服用,治疗四周。以尿量增加和体重减轻为指标。结果显示,五苓方散剂组的疗效显著优于五苓方汤剂组,五苓方散剂以不足其同方汤剂三分之一的小剂量,却取得了疗效显著优于其同方汤剂的临床疗效。该文进一步对五苓方同方汤、散剂的化学成分进行比较,发现五苓方汤剂的一组非挥发低极性分子含量仅为其同方散剂的1/450。基于上述研究结果,本文提出了“宜散方若采用汤剂使用,将导致低极性成分缺失,从而影响宜散方临床疗效”的假说。我们认为即使考虑到中药复方化学成分间的相互增溶或助溶现象,水对低极性成分的提取能力仍然相当有限,从而导致药材的低极性化学成分未被提取或未被充分提取,而当这些低极性成分中存在有效成分时,则该方宜散不宜汤。与宜散方的散剂相比,汤剂易损失的低极性成分包括非挥发低极性成分和挥发低极性成分。在现代制剂过程中,挥发低极性成分已经被充分注意和保留,比如使用环糊精包合技术防止挥发油损失等,因此本文重点研究宜散方以汤剂应用的低极性成分缺失,以及现代制剂的非挥发低极性成分缺失。如果采用现代研究手段证实宜散不宜汤方的同方汤剂和散剂确实存在上述本质差异,进而揭示其科学内涵,那么将证明宜散不宜汤方的现代剂型改革不仅已经将中医的一些宝贵经验丢失,而且中成药前期科研投入巨大,如果将宜散方散剂不经深入研究而草率改为汤剂,相对于散剂而言,汤剂系列的中成药制备工艺非常复杂,如提取,浓缩、包合等,增加如此多的步骤得到的制剂功效却远不及其原粉散剂,由此造成的损失是触目惊心的。本实验主要对五苓方同方汤剂和散剂的低极性差异成分及其主要药效学进行了研究。其中低极性差异成分研究分两部分,主要包括五苓散醇提物化学成分分离,以及五苓方同方汤剂和散剂主要差异成分香豆素、桂皮醛、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、大黄酚、白术内酯Ⅰ、23-乙酰泽泻醇B、麦角甾醇在五苓方汤剂、散剂以及煎汤后的药渣进行了含量比较研究；药效学研究主要进行三种汤剂缺失成分,包括麦角甾醇、香豆素、23-乙酰泽泻醇B影响肾小管上皮细胞HK-2的AQPs (aquaporins,AQPs) mRNA和蛋白表达,这三种成分对Wistar大鼠利尿作用及其影响肾脏AQPs mRNA和蛋白表达的研究。本文对五苓方宜散不宜汤的物质基础研究,采用95%乙醇回流提取五苓方药材饮片,减压回收溶剂,用水分散浓缩物,分别用石油醚和乙酸乙酯萃取水分散液,得到石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物。经正相硅胶柱和ODS柱,分离得到麦角甾醇和香豆素两个化合物。并通过对汤剂和散剂低极性化学成分差异研究,对香豆素、桂皮醛、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、大黄酚、白术内酯Ⅰ、23-乙酰泽泻醇B和麦角甾醇八种汤剂缺失的低极性化学成分进行了归属,并经高效液相色谱分析发现,香豆素在散剂提取液中含量是汤剂中的8.44倍,与散剂相比,汤剂中香豆素含量损失高达88.16%；散剂提取液中23-乙酰泽泻醇B的含量是汤剂提取液的55.74倍,汤剂中23-乙酰泽泻醇B损失约98.21%；汤剂提取液中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ分别损失98.8%和89.02%,而在汤剂中桂皮醛、大黄酚、白术内酯Ⅰ和麦角甾醇均完全缺失,即在汤剂中用高效液相色谱方法检测不到。本文对市售五苓胶囊中低极性成分缺失情况也进行了比较研究,结果表明,五苓胶囊虽然采用了各种复杂的制备工艺,但五苓胶囊低极性成分严重缺失,尤其是低极性非挥发类化学成分几乎完全缺失,虽然五苓胶囊制备工艺中采用环糊精包合技术在理论上保留了桂枝及白术中挥发性成分,但与同等药材饮片组成的散剂而言,桂皮醛的仍损失60%之多,白术内酯Ⅱ损失超过40%。本文的药效学研究部分,评价了麦角甾醇、香豆素、23-乙酰泽泻醇B三种汤剂缺失成分对HK-2细胞上AQP1、AQP4 mRNA和蛋白的表达的影响。采用MTT方法,选择各化合物的高、中和低剂量,以抑制率小于10%作为判定对细胞无毒性的标准。麦角甾醇选择的高、中和低剂量分别为25μM,12.5μM, 6.25μM;香豆素对细胞几乎无明显毒性,当香豆素剂量在100uM时,对HK-2细胞抑制率也只有10.33%。由于其无细胞毒性,所以选择高、中和低浓度分别100μM,50μM,25μM;23-乙酰泽泻醇B的高、中和低浓度分别为6.25μM,1.5625μM, 0.390625μM;阳性对照药氢氯噻嗪选择浓度为12.5μM,对HK-2细胞抑制率为7.69%。本实验还增加了LDH漏出率指标来进一步检测三种化学成分对HK-2细胞的损伤程度。结果表明,随着化合物浓度增大,对细胞的损伤程度也逐渐增大,麦角甾醇、香豆素和23-乙酰泽泻醇B的最大给药剂量分别为25μM、100μM、6.25uM,最大剂量时的LDH漏出率分别为60.81%、44.37%、76.68%,氢氯噻嗪和阴性对照组的LDH漏出率分别为61.02%和33.15%,包括阳性药在内,对细胞损伤的严重程度由大到小依次为23-乙酰泽泻醇B、氢氯噻嗪、麦角甾醇和香豆素。通过PCR检测结果可知香豆素高、低剂量组和23-乙酰泽泻醇B高、中剂量组能显著降低HK-2细胞AQP1 mRNA表达；麦角甾醇高、中、低剂量组,香豆素高、中、低剂量组和23-乙酰泽泻醇B高、中、低剂量组均可显著降低HK-2细胞AQP4 mRNA表达。Western Blot检测结果显示,麦角甾醇高、中剂量组,香豆素高、中、低剂量组和23-乙酰泽泻醇B高剂量组均可显著降低HK-2细胞AQP1蛋白表达；麦角甾醇高、中、低剂量组,香豆素高、中剂量组和23-乙酰泽泻醇B高剂量组均可显著降低HK-2细胞AQP4蛋白表达。以上结果表明麦角甾醇中剂量组、香豆素高剂量组、23-乙酰泽泻醇B高剂量组能够显著降低HK-2细胞AQP1和AQP4蛋白表达,纠正AQP1和AQP4的表达速率,进而调节体内水代谢的平衡。本文通过对麦角甾醇、香豆素、23-乙酰泽泻醇B三种汤剂缺失成分的利尿药活性进行了研究。动物筛选：雄性Wistar大鼠180-200g,预先置于代谢笼中1日适应环境。实验前18h禁食不禁水,灌胃去离子水25ml/kg,立刻置于代谢笼中,收集2h尿液,尿量达灌入水量40%者,为水负荷合格动物。将筛选合格的动物分为5组,每组8只。动物分组和给药方法如下：正常对照组,灌胃给与1%的盐水2.5ml；麦角甾醇组(35mg/kg),灌胃给予含有适宜浓度麦角甾醇的等量生理盐水；香豆素组(50mg/kg),灌胃给予含有适宜浓度香豆素的等量生理盐水；23-乙酰泽泻醇B组(50mg/kg),灌胃给予含有适宜浓度23-乙酰泽泻醇B的等量生理盐水；氢氯噻嗪组(10mg/kg),灌胃给予含有适宜浓度氢氯噻嗪的等量生理盐水。各组大鼠每天灌胃给药一次,给药体积为25ml/kg,连续灌胃给药8天,给药第1天及第7天将大鼠置于代谢笼内收集给药后6h内的尿液,并记录尿液体积；第8天给药1h后,给与5Omg/kg腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,取肾脏,一份置于液氮中速冻,保存于-80℃冰箱；一份固定保存。检测指标：尿量以及AQP1、 AQP2、AQP4的mRNA和蛋白表达。结果显示麦角甾醇组Wistar大鼠在给药第1天和给药第7天后尿量显著增加,麦角甾醇有显著的利尿作用,而香豆素和23-乙酰泽泻醇B显示有利尿趋势,但均无统计学差异。麦角甾醇的利尿作用在给药6小时内发挥作用。麦角甾醇组Wistar大鼠肾脏AQP1和AQP4 mRNA表达显著下调,且AQP1、AQP2和AQP4蛋白表达也显著减少,说明麦角甾醇可能通过调节AQP1、AQP2和AQP4蛋白表达机制产生利尿作用；对于香豆素和23-乙酰泽泻醇B组Wistar大鼠与模型组的尿量无显著差异,但是这两组Wistar大鼠肾脏AQP4 mRNA和蛋白表达均显著下调,这说明香豆素和23-乙酰泽泻醇B对大鼠体内水的输布也产生了潜在的调节活性。通过以上研究可知,与五苓方散剂相比,五苓方汤剂存在低极性化学成分缺失的现象,且缺失化学成分中存在利尿活性成分,这些活性成分对水通道蛋白的表达具有一定的影响。本论文为研究宜散不宜汤方的药效物质基础提供了新的思路和研究方向,并对临床用药剂型的选择提供参考依据。