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人胞质亮氨酰-tRNA合成酶(hcLeuRS)是人细胞中氨基酰-tRNA合成酶复合物(Multi-synthetase Complex，MSC)的一个组分。人胞质aaRS的研究对药物筛选和了解它的其它非经典功能非常重要。本实验室此前已经使用大肠杆菌表达系统表达并纯化了hcLeuRS，但是由于长期以来通过体外转录的方式获得人胞质tRNALeu(hctRNALeu)具有产量少、活力低的缺点，所以对于hcLeuRS酶学性质的认识有限。为了解决获得hctRNALeu的瓶颈问题，我们用大肠杆菌表达系统成功地高表达了hctRNALeu的基因，并通过DEAE阳离子交换柱和C4反相层析柱两步纯化得到将近100％纯度的hctRNALeu。比较通过以前实验室传统的体外转录方法得到的hctRNALeu(TS-hctRNALeu)和目前方法得到的hctRNALeu(OE-hctRNALeu)的理化性质，发现OE-hctRNALeu的热稳定性明显高于转录产物，其氨基酸接受活力是hctRNALeu转录本的10倍。这样我们就建立起hcLeuRS/hctRNALeu高效体外测活体系，为进一步研究hcLeuRS的编校功能提供了便利。另外，我们也对于hctRNALeu表达产物的碱基修饰功能进行了探索，发现反密码子环上37位的鸟嘌呤对于hctRNALeu识别至关重要。
aaRS催化特定的氨基酸与其对应的tRNA的连接反应，对遗传信息的精确翻译至关重要。为了防止对非对应氨基酸的误活化和对应tRNA的误氨基酰化给蛋白质合成带来潜在的错误，一些aaRS进化出编校机制，能够水解误活化的氨基酸（转移前编校）或误氨基酰化的tRNA(转移后编校)。作为第一类酶a亚类的合成酶中的LeuRS能够活化多种天然或非蛋白质的氨基酸，例如正缬氨酸(Nva)和α-氨基丁酸(ABA)等，并使其接载到对应的tRNALeu上。在本研究中，实验数据表明，hcLeuRS能够根据不同非对应氨基酸的威胁，表现不同的编校行为。在编校Nva时，hcLeuRS偏好使用转移后编校途径，而在编校ABA时，hcLeuRS主要使用转移前编校途径，虽然hctRNALeu都能被这两种非对应氨基酸氨基酰化。并且，体外的测活实验表明hcLeuRS的转移后编校作为整个反应最后一个检查点，对于防止非对应氨基酸的错误掺入发挥着重要作用。这些结果很好地揭示了hcLeuRS能够采取一种模块化的编校途径，行使编校功能，从而确保生物体内精确地从信使核糖核酸翻译为蛋白质，具有与其生物相适应的进化上的优越性。
tRNA作为连接遗传信息和对应氨基酸之间的“接头分子”，是蛋白质合成中的关键生物大分子。基于hctRNALeu制备方法的改进，我们可以继续深入研究其细胞学功能。在本研究中，我们成功建立了hctRNALeu生物素3’-末端专一标记的体外修饰体系。利用生物素与亲和素牢固结合的性质，成功地从293T细胞裂解液中分离出与hctRNALeu相互作用蛋白质，进而通过质谱技术鉴定出其中的一个目标蛋白质为富嘧啶区结合蛋白关联剪接因子(polypyrimidine tract-binding protein-associatedsplicing factor，PSF)。成功地建立了人PSF基因(hPSF)在大肠杆菌以及哺乳动物细胞中的表达系统，同时获得了纯度在95%以上的hPSF重组蛋白质。生物大分子相互作用分析系统(Biacore)和电泳迁移实验(EMSA)的数据都表明，hctRNALeu能够与hPSF相互作用，与之前的体外筛选结果相吻合。同时，我们在HeLa细胞内共转染hctRNALeu和hPSF发现，原本定位在核内的hPSF在hctRNALeu作用下异常地分布在细胞质。我们猜测hctRNALeu可能与hPSF相互作用后影响了后者入核扮演mRNA剪接因子和抑制某些致癌基因转录的角色。
具有经典三叶草二级结构的tRNA作为细胞蛋白质合成机器的重要元件，已经拥有几十年的深入细致的研究历史。但是，对于其全部功能的认识远无止境，尤其在其作为潜在的基因表达调控分子前体的功能目前正逐渐被人们认识。最新的多项研究结果表明，在多种细胞系中通过高通量测序发现某种来源于tRNA的小片段RNA，这些剪切产物被认为与多种microRNA加工体系关键分子如Dicer、Ago家族中的蛋白质具有相互作用的能力。基于此，我们通过与最新的miRBase数据库进行比对，发现小分子RNA(miR-1280)与hctRNAAAGLeu的3’-末端序列同源。我们以标记生物素的hctRNALeu为底物，分别采用Dicer以及293T细胞裂解液共保温，发现二者都能够将hctRNAAAGLeu切割成小分子RNA，尤其是在细胞裂解液作用下，可以被加工成类似microRNA的片段大小，暗示了hctRNAAAGLeu成为microRNA前体的可能性。同时，我们也对于共享平台(TargetScan)预测的来源于hctRNAAAGLeu的3’-末端序列的miR-1280的靶基因进行了筛选，通过双荧光报告系统发现转录因子NFIX有可能作为其下游的靶基因之一。而且，我们利用RT-qPCR技术也同样发现NFIX在mRNA水平上与miR-1280表达水平相关，进一步确认了二者之间的联系。如果其具体的作用机制能够被更多的实验结果阐明，将极大地扩展我们对于非编码RNA(包括tRNA在内)的调控功能的认识。