目的:随着肿瘤发病率的逐年升高,抗肿瘤药物治疗的有效性及安全性已成为重点关注的问题,其中化疗所诱导的骨髓抑制为临床常见不良反应。近年来,益气补血类中药已应用于防治骨髓抑制。圣愈汤为传统益气补血名方,由熟地黄、白芍、当归、川芎、人参、黄芪组成。药效学研究显示圣愈汤具有治疗化疗诱导的骨髓抑制作用,但其治疗骨髓抑制的药效物质基础和作用机制尚不明确。因此,本研究针对上述问题,对圣愈汤进行了体内外化学成分分析;在成分分析基础上结合网络药理学和分子对接技术探究其防治骨髓抑制的可能作用机制和药效成分;验证预测成分的活性并初步探索作用机制;考察主要药效成分的药代动力学行为。通过上述研究,旨在阐明圣愈汤防治骨髓抑制的药效物质基础和作用机制,为圣愈汤的临床应用提供理论依据。研究方法:1、圣愈汤体内外成分鉴定:建立基于LC-QTOF/MS的圣愈汤体内外成分定性分析方法:采用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,3.5μm）,以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱;质谱采用ESI源,TOF MS-IDA-MS/MS扫描模式,分别在正、负离子模式下采集圣愈汤水提取液和含药血清中所含成分的质谱信息。构建圣愈汤化学数据库,采用Peak View?V.2.2工作站进行数据处理,对圣愈汤及入血化学成分进行定性研究。2、圣愈汤入血成分的网络药理学和分子对接研究:利用TCMSP和Swiss Target Prediction数据库检索圣愈汤入血成分的作用靶点;应用Gene Cards和OMIM数据库检索骨髓抑制相关靶基因;应用Venny 2.1软件筛选圣愈汤治疗骨髓抑制的潜在作用靶点。应用DAVID数据库对潜在作用靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析,预测圣愈汤可能参与的生物过程和作用机制。将潜在作用靶点导入STRING平台构建PPI网络,并应用Cytohubba插件筛选Hub蛋白。应用i GEMDOCKv 2.1和Autodock Tools 1.5.6对入血成分和Hub蛋白进行分子对接,预测圣愈汤的药效成分。3、圣愈汤药效成分验证及其调节骨髓基质细胞PI3K-Akt信号通路影响细胞增殖和凋亡的机制研究:对分子对接预测的可能药效成分-芍药苷、芍药内酯苷、毛蕊异黄酮苷和阿魏酸进行药效学验证,考察上述四个成分对5-FU作用后OP9细胞增殖的影响,筛选药效作用强的成分进行后续机制研究。以5-FU处理OP9细胞,建立化疗药物诱导的骨髓基质细胞损伤模型。设立对照组、5-FU组、5-FU+芍药内酯苷组、5-FU+芍药内酯苷+LY294002（PI3K-Akt通路抑制剂）组和5-FU+LY294002组。流式细胞术检测OP9细胞的凋亡和细胞周期;Western Blot检测OP9细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、p21和Cyclin D1蛋白的表达。验证芍药内酯苷是否通过激活PI3K-Akt信号通路影响骨髓基质细胞的增殖和凋亡。4、圣愈汤药效成分的药代动力学研究:为考察中药复方中不同成分的可能相互作用,建立同时测定大鼠血浆中芍药苷、芍药内酯苷、毛蕊异黄酮苷和阿魏酸四个药效成分的UPLC-MS/MS方法:以甘草苷为内标,血浆样品采用甲醇沉淀蛋白,Poroshell 120 SB C18（4.6×250 mm,5μm）色谱柱进行分析,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,质谱采用ESI负离子模式,扫描方式为MRM,并进行了系统的方法学验证。应用所建立的方法考察芍药苷、芍药内酯苷、毛蕊异黄酮苷和阿魏酸四种成分在大鼠体内的药代动力学行为。结果:1、建立基于LC-QTOF/MS的圣愈汤体内外化学成分定性分析方法,鉴定并归属了药材来源。圣愈汤中共鉴定出148个色谱峰,主要包括熟地黄中的苯乙醇苷类、环烯醚萜类、单萜类和氨基酸类等,共42个;白芍中的单萜苷类、三萜类和黄酮类等,共37个;黄芪中的黄酮类等,共22个;人参中的人参皂苷类等,共32个;当归和川芎中的有机酸类和内酯类等,共15个。在此基础上,根据中药血清药物化学理论,对圣愈汤在大鼠体内的暴露组分进行了分析,148个体外成分中共有33个成分以原型吸收入血。圣愈汤吸收入血的原型成分主要为苯乙醇苷类、黄酮类、单萜苷类、内酯类和有机酸类。2、基于网络药理学和分子对接技术预测圣愈汤治疗骨髓抑制的作用通路、靶点和药效成分:从TCSMP和Swiss数据库中检索33个入血成分相关靶点,其中有5个成分缺少预测靶点数据,所以共计得到了28个有效的成分,后续网络构建和分子对接均围绕该28个成分进行。进行汇总、去重后共得到化合物相关靶点113个;从Gene Cards和OMIM数据库中,共检索到骨髓抑制相关靶点7649个,以“score≥4.0”为标准,共筛选得到2946个疾病相关靶点;二者取交集共得到62个交集靶点。GO分析发现圣愈汤治疗骨髓抑制可能与其参与凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控等生物过程相关;KEGG通路富集分析发现圣愈汤治疗骨髓抑制的信号通路主要包括PI3K-Akt通路、HIF-1通路、雌激素通路和VEGF通路等。PPI网络共有58个节点（4个靶蛋白未参与）,374条相互作用线。筛选得到6个Hub蛋白:TNF、IL-6、VEGFA、SRC、HRAS和STAT3。将28个参与构建网络药理学的入血成分与6个Hub蛋白进行分子对接,其中阿魏酸、氧化芍药苷、芍药苷、芍药内酯苷和毛蕊异黄酮苷与上述6个蛋白均具有较好的结合。提示它们可能存在治疗骨髓抑制活性,是圣愈汤发挥作用的潜在药效成分。3、圣愈汤药效成分验证及其调节骨髓基质细胞PI3K-Akt信号通路影响细胞增殖和凋亡的机制研究:5-FU处理OP9细胞后:细胞发生G1期阻滞,细胞凋亡率显著增加;PI3K和Akt的蛋白表达和磷酸化水平均显著降低;Bcl-2、Cyclin D1表达显著减少,p21和Bax表达显著增多。芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸和毛蕊异黄酮苷可显著逆转5-FU诱导的OP9细胞增殖抑制作用。其中,芍药内酯苷逆转作用最强,选作后续机制研究。5-FU损伤的OP9细胞经芍药内酯苷处理后:细胞中PI3K和Akt的蛋白表达和磷酸化水平均显著升高;Bcl-2、Cyclin D1表达显著增多,p21和Bax表达显著减少;细胞G1期阻滞显著减轻,细胞凋亡率显著下降。而经PI3K-Akt通路抑制剂LY294002处理后,芍药内酯苷的逆转作用显著减弱。提示芍药内酯苷通过激活PI3K-Akt通路,提高Akt磷酸化水平,影响下游细胞凋亡和细胞周期相关蛋白表达,从而逆转5-FU诱导的骨髓基质细胞凋亡和细胞周期阻滞。4、圣愈汤药效成分的药代动力学研究:建立了同时测定大鼠血浆中四种药效成分的UPLC-MS/MS方法,并用于考察圣愈汤中四种药效成分的药代动力学特征:在所确定的条件下,阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、毛蕊异黄酮苷和内标峰形良好。选择性、精密度、准确度、线性、回收率、基质效应、残留考察和稳定性考察均符合方法学要求。阿魏酸、毛蕊异黄酮苷、芍药内酯苷和芍药苷均可在5 min内迅速吸收入血;Cmax分别为1571.07±1329.48 ng/m L,21.16±19.31 ng/m L,1469.91±721.08 ng/m L和2777.38±1719.53 ng/m L;t1/2分别为0.76±0.25 h,4.41±3.39 h,9.39±1.12 h和4.27±3.15 h;AUC（0-t）分别为1622.36±1201.40 ng·h/m L,21.04±19.12 ng·h/m L,1752.35±442.22 ng·h/m L和4361.98±2284.52 ng·h/m L;Tmax分别为0.14±0.04 h,0.16±0.07 h,0.29±0.14 h和0.29±0.14 h。结论:本研究建立的LC-QTOF/MS方法鉴定了圣愈汤提取液和大鼠灌胃圣愈汤后血清中的化学成分,初步阐明了圣愈汤的化学物质基础;预测了圣愈汤的潜在活性成分及作用靶点;筛选并验证了阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷和毛蕊异黄酮苷四个成分的药效,其中芍药内酯苷逆转5-FU诱导的骨髓基质细胞增殖抑制作用最强。芍药内酯苷通过激活PI3K-Akt信号通路,减少5-FU诱导的骨髓基质细胞凋亡并解除细胞周期阻滞,推测PI3K-Akt信号通路是芍药内酯苷缓解5-FU所致骨髓基质细胞损伤的机制之一;应用所建立的UPLC-MS/MS方法,考察了大鼠血浆中芍药苷、芍药内酯、毛蕊异黄酮苷和阿魏酸四个药效成分的药代动力学行为,为圣愈汤的临床安全、合理应用提供依据。