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目的:脓毒症是由宿主对感染的异常反应而引起的器官功能紊乱。而微循环和内皮功能稳态是维系机体脏器功能的重要防线。从大动脉到静脉,内皮细胞无处不在,其作为血管非常规免疫细胞,尽管结构因器官而异,但这种单细胞层在调节血管张力、炎症反应、凝血以及调控通透性等方面,发挥着至关重要的作用。此外,内皮细胞也参与了从外周到近心血管的信息传递,从而使灌注与代谢需求精确匹配。脓毒症时内皮细胞经历了多种表型和功能的改变,引起微循环功能障碍和多器官功能衰竭。而脓毒症复苏策略的目的是保护内皮细胞并恢复其屏障保护功能。多糖包被为富含硫酸肝素的糖胺聚糖和蛋白多糖构成,几乎覆盖所有健康血管的血管内皮细胞,主要参与微血管屏障功能的维护、白细胞迁移、局部抗凝和微血管流体力学。脓毒症时由于受到脂多糖以及多种炎性介质的作用,多糖包被层被降解、变薄,致使微血管流变学改变,影响毛细血管血流,最终影响组织灌注。多糖包被急性损伤后大约需要5-7天才能恢复,但完全恢复水动力活性可能需要更长时间。这种延迟的修复可部分解释为什么脓毒症患者尽管优化了大循环的血流动力学,但微循环血流仍然无法恢复。故基于血管内皮损伤,探讨脓毒症微循环障碍的发病机制是重症医学领域目前研究的热点。本研究从临床、动物及细胞三个水平,探讨在脓毒症患者中具有差异表达的micro RNA基因谱,通过筛选差异靶向MMP9的血清外泌体micro RNA,探讨其在脓毒症血管内皮多糖包被降解中的作用机制;通过差异靶向MMP9的血清外泌体micro RNA干预,探讨其对脓毒症小鼠血管内皮的保护作用。研究方法:(1)根据脓毒症3.0定义以及诊断标准、纳入标准,收集华北理工大学附属医院2020年7月15日至2021年4月30日入住重症医学科的脓毒症患者的临床资料、血清标本,共50人。同期收集性别、年龄均衡可比的健康人群为对照组,共45人临床资料,如性别、年龄、APACHEⅡ评分、SOFA评分、机械通气情况、合并的包括高血压病等在内的慢性疾病、包括呼吸系统、胆道系统等在内的原发感染灶、ICU停留时间等;(2)利用超高速差速离心方法提取血清外泌体,利用透射电镜、NTA及Westernblot等方法对提取的外泌体进行鉴定及表征;(3)提取外泌体中总RNA进行基于Illumina Hiseq2000/2500的micro RNA测序,对测序结果进行micro RNA鉴定和表达量分析、micro RNA差异分析、靶基因功能注释等,进一步筛选靶向脓毒症血管损伤相关基因的micro RNA并进行验证;(4)采用盲肠结扎与穿孔法建立脓毒症小鼠模型,观察动物临床特征及死亡情况,利用组织病理学、分子生物学及免疫学等检测手段,观察小鼠主动脉及肺脏组织病理学变化、主动脉多糖包被损伤情况及相关蛋白的变化,检测小鼠外周血外泌体中靶向MMP9的mi R-133a表达水平;(5)建立LPS感染HUVECs细胞模型,利用CCK8方法检测不同浓度LPS对HUVECs细胞增殖的影响,利用分子生物学及免疫学等检测手段,观察细胞MMP9蛋白及m RNA表达情况。同时利用合成的mi R-133a mimic进行干预实验,观察细胞MMP9蛋白及m RNA表达情况。(6)利用合成的mi R-133a mimic进行尾静脉干预脓毒症小鼠模型,利用组织病理学、分子生物学及免疫学等检测手段,观察小鼠主动脉及肺脏组织病理学变化、主动脉多糖包被损伤情况及相关蛋白的变化,检测小鼠外周血外泌体中靶向MMP9的mi R-133a表达水平。结果:(1)本研究纳入脓毒症患者50例,平均年龄为58.54岁,31例(62.00%)为男性,19例(38.00%)为女性。对照组人群共纳入45例,平均年龄为54.31岁,33例(73.33%)为男性,12例(26.67%)为女性。两组人群的性别、年龄无统计学差异(P>0.05),两组人群的白细胞计数、CRP、PCT、TNF-α、IL-1β、IL-6、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、TBIL、BUN、血Cr等变量在两组间比较均有统计学差异(P<0.05)。本次研究中用于外泌体测序的血清样本共13份,其中脓毒症患者8人,平均年龄50.88岁,5例(62.50%)为男性;对照组5人,平均年龄50.20岁,3例(60.00%)为男性。此次用于外泌体测序的人群经比较性别、年龄后,显示无统计学差异(P>0.05);(2)应用超高速差速离心法提取外泌体,经透射电镜、NTA及Westernblot检测结果显示,提取物具有外泌体典型形态结构及表面标志物;(3)利用高通量测序方法对提取外泌体的micro RNA进行分析,结果显示脓毒症患者和对照人群差异表达micro RNA共221个,其中93个上调micro RNA,128个下调micro RNA,靶基因显著富集于pathways in cancer、PI3K-Akt signaling pathway、regulation of actin cytoskeleton、Ras signaling pathway、Rap1 signaling pathway、purine metabolism、p53 signaling pathway、Glycolysis/Gluconeogenesis、Fatty acid degradation、amino sugar and nucleotide sugar metabolism、pyrimidine metabolism等通路中。筛选靶向MMP9的micro RNA检测结果显示,脓毒症患者mi R-133a及mi R-183、mi R-204表达水平均低于对照组(P<0.05);(4)本研究动物模型采用盲肠结扎穿孔术制备,结果显示72h小鼠生存率为50%。CLP造模组小鼠血管平滑肌细胞间距增大,肌细胞间质水肿及少量炎细胞浸润,平滑肌细胞分离呈波浪状。主动脉及肺血管结构多糖包被出现脱落现象。主动脉中syndecan-1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而小鼠血清中MMP9表达水平较假手术组显著升高(P<0.05);(5)LPS处理HUVECs 24h后,10-1000μg/ml处理组与对照组细胞增殖能力相比无差异(P>0.05)。在40μg/ml LPS处理HUVECs 6h及12h后,检测细胞中MMP9蛋白荧光信号增强,蛋白及m RNA表达逐渐升高(P<0.05),利用合成的mi R-133a mimic对LPS染毒HUVECs进行干预结果显示,细胞MMP9蛋白及m RNA相对表达量随时间明显降低(P<0.05);(6)mi R-133a mimic尾静脉干预CLP造模脓毒症小鼠96h存活率为70%,明显高于CLP脓毒症小鼠。组织病理学观察显示mi R-133a mimic干预能够改善脓毒症小鼠主动脉及肺组织损伤,多糖包被脱落减少,且干预后小鼠syndecan-1表达显著增多(P<0.05),同时MMP9蛋白和m RNA表达显著下降(P<0.05)。结论:患者在遭受脓毒症打击后,其血清外泌体中mi RNA的表达谱发生改变,其中靶向血管多糖包被降解因子MMP9的mi R-133a表达具有显著性差;利用CLP方法建立的脓毒症小鼠血管受到损伤,且血管多糖包被出现降解,靶向调控MMP9的mi R-133a干预可起到保护脓毒症血管内皮、防止多糖包被降解的作用。