支气管哮喘(简称哮喘)是一种气道慢性炎症性疾病,其本质上是一种由多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)、炎性介质和细胞因子网络共同参与的变态免疫反应性疾病。哮喘作为严重危害各年龄段人群健康的复杂性、难治性重大疾病,其发病率呈逐年上升趋势,是当前研究的热点之一。中医药治疗哮喘具有悠久的历史和自身特色,其在弥补了西药治疗支气管哮喘价格较高、毒副作用较大及需要长期使用等缺点后,在不断的医疗实践中被人们认可。其中中药外治法又有其独特的优势,它不仅可以起到内服药不能达到的效果,并且有助于减轻哮喘发作期的症状,特别是在预防哮喘发作和哮喘缓解期的治疗中发挥重要的作用。作为一种新型外用制剂的巴布剂,凭借其本身的独特优势目前已被广泛应用。本课题所使用的麻芥平喘巴布剂是由麻黄、白芥子、延胡索、苦杏仁、生姜汁制成。麻芥平喘巴布剂作为一种治疗哮喘的新型制剂,以期获得对哮喘的发作期和缓解期具有治疗作用。因此,本课题将从麻芥平喘巴布剂的皮肤安全性研究、对支气管解痉作用、抗气道炎症作用和作用机制研究四个方面进行实验研究,从而评价麻芥平喘巴布剂的安全性和治疗效果并部分阐明其作用机理。目的1.通过制备不同种属皮损动物模型,进行给药动物实验,探讨麻芥平喘巴布剂皮肤用药的安全性。2.通过离体实验,观察麻芥平喘巴布剂对豚鼠离体气管平滑肌的作用,探讨麻芥平喘巴布剂缓解支气管痉挛的作用机理。3.通过制备BN大鼠哮喘模型,给予药物治疗,观察麻芥平喘巴布剂对哮喘动物模型的药效作用。4.通过进一步研究胸腺基质淋巴生成素(TSLP)的变化,探讨麻芥平喘巴布剂治疗哮喘的作用机制。方法1.通过对健康家兔皮肤急性毒性实验及刺激性实验、健康豚鼠皮肤过敏性实验,观察麻芥平喘巴布剂对动物经皮肤用药的急毒、刺激和过敏性。2.制备豚鼠离体气管螺旋条,分别观察麻芥平喘巴布剂对磷酸组胺和氯化乙酰胆碱所致豚鼠气管平滑肌收缩的拮抗作用。3.制备OVA致敏BN大鼠哮喘模型,观察麻芥平喘巴布剂对外周血和肺泡灌洗液中白细胞分类计数、肺功能和肺组织损伤的影响。4.制备OVA致敏BN大鼠哮喘模型,采用免疫组化和放免法观察麻芥平喘巴布剂对大鼠血清、BALF、胸腺、皮肤和肺组织中TSLP的影响。结果1.麻芥平喘巴布剂皮肤用药的安全性：麻芥平喘巴布剂对家兔完整皮肤和破损皮肤未引起急性毒性反应；对家兔完整皮肤和破损皮肤有轻度刺激性,但给药后48h,这种刺激性消失；对豚鼠完整皮肤无致敏作用。2.麻芥平喘巴布剂对豚鼠离体气管平滑肌的作用：麻芥平喘巴布剂药物成分对氯化乙酰胆碱和磷酸组胺刺激引起的豚鼠离体气管条平滑肌收缩有明显的拮抗作用,并呈明显的量效关系3.麻芥平喘巴布剂的平喘作用：麻芥平喘巴布剂治疗组和阳性药地塞米松(Dex)均能延长OVA致敏大鼠哮喘的引喘潜伏期。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组有显著差异(P<0.05)。4.肺功能检测结果：与空白组相比,模型组在Mch浓度为3.125mg/ml、6.25mg/ml和12.5mg/ml具有极显著差异(P<0.01)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能降低气道对Mch的反应性。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组在Mch浓度为3.125mg/ml和6.25mg/ml时具有极显著差异(P<0.01),在Mch浓度为12.5mg/ml使具有显著性差异(P<0.05)。5.全血中EOS计数结果：模型组外周血嗜酸性粒细胞数升高,与正常组相比有极显著差异(P<0.01)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能减少OVA致敏哮喘大鼠外周血嗜酸性粒细胞数。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组有极显著差异(P<0.01)。6. BALF中WBC分类计数结果：模型组嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数明显升高,与正常组相比有极显著差异(P<0.01)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能降低大鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组具有显著性差异(P<0.05)。模型组单核细胞数降低,与正常组相比有显著性差异(P<0.05)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能升高大鼠BALF中单核细胞数。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组具有显著性差异(P<0.05)。7.肺组织病理切片HE染色结果：空白组未见炎性细胞浸润,气道上皮无增厚,肺泡壁结构完整。模型组气道粘膜下及管壁可见明显炎症细胞浸润,气道管壁增厚及上皮细胞脱落。与模型组比较,麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组气道炎症反应较轻,气道管壁有少量炎性细胞浸润,未见肺组织有明显病理损伤。8.免疫组化结果：肺组织：模型组肺组织中TSLP的积分光密度值升高,与空白组相比,具有极显著性差异(P<0.01)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能降低OVA致敏大鼠肺组织中TSLP的积分光密度值。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组具有显著性差异(P<0.05)。皮肤：模型组皮肤中TSLP的积分光密度值升高,与空白组相比,具有极显著性差异(P<0.01)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能降低OVA致敏大鼠皮肤中TSLP的积分光密度值。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组具有显著性差异(P<0.05)。9.血清、BALF.肺组织、皮肤及胸腺中TSLP含量Elisa检测结果：血清：模型组血清中TSLP水平升高,与空白组相比具有显著性差异(P<0.05)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能够降低OVA致敏大鼠血清中TSLP含量水平。与模型组相比,Dex阳性组具有极显著性差异(P<0.01),麻芥平喘巴布剂治疗组具有显著性差异(P<0.05)。BALF:模型组BALF中TSLP水平升高,与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能降低OVA致敏大鼠BALF中TSLP含量水平。与模型组相比,Dex阳性组具有极显著性差异(P<0.01),麻芥平喘巴布剂治疗组具有显著性差异(P<0.05)。肺组织：模型组肺组织中TSLP水平升高,与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能降低OVA致敏大鼠肺组织中TSLP含量水平。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组具有显著性差异(P<0.05)。皮肤：模型组皮肤中TSLP水平升高,与空白组相比具有显著性差异(P<0.05)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能降低OVA致敏大鼠皮肤中TSLP含量水平。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组具有显著性差异(P<0.05)。胸腺：模型组胸腺中TSLP水平升高,但与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组均能升高OVA致敏大鼠胸腺中TSLP含量水平。与模型组相比,麻芥平喘巴布剂治疗组和Dex阳性组具有极显著性差异(P<0.01)。结论1.麻芥平喘巴布剂临床用药安全、无毒。2.麻芥平喘巴布剂具有良好的平喘作用。离体实验表明,麻芥平喘巴布剂药物成分对磷酸组胺和氯化乙酰胆碱引起的豚鼠气管平滑肌收缩有显著地拮抗作用。3.麻芥平喘巴布剂对BN大鼠哮喘动物模型能够起到治疗作用。肺功能检测结果表明麻芥平喘巴布剂对于Mch引起的气道平滑肌痉挛有很好的拮抗作用；WBC分类计数可见其能显著降低EOS及中性粒细胞等多种炎症细胞数目；HE染色表明其能够减轻哮喘动物模型的肺组织病理损伤。4.麻芥平喘巴布剂对BN大鼠哮喘模型的治疗是通过调节不同组织的TSLP水平来实现的。肺组织和皮肤免疫组化TSLP检测及血清、BALF、皮肤和肺组织匀浆TSLP检测结果均表明,麻芥平喘巴布剂治疗组TSLP低表达,而模型组TSLP高表达,可见麻芥平喘巴布剂可以通过调节不同组织的TSLP水平进而对哮喘动物起到治疗作用。可见,麻芥平喘巴布剂对BN大鼠哮喘动物模型能够起到较好的治疗作用,并通过调节不同组织的TSLP水平进而对哮喘动物起到治疗作用,其对哮喘的治疗作用及其他调节机制有待于临床进一步证实。