论文部分内容阅读
黑参是以人参为起始原料,经反复蒸制、烘干而成的炮制品。具有肝肾保护、神经保护、抗癌、抗衰老等药理活性。人参皂苷类成分是其主要活性物质。与白参、红参不同,黑参中人参皂苷Rg3、（20R）-Rg3、Rs3、（20R）-Rs3、Rk1、Rg5、Rh2、（20R）-Rh2、CK等稀有皂苷的含量大大提高。国内外对黑参的化学成分研究集中在单体皂苷鉴定和含量测定两个方面,生物活性研究集中在水/醇提取物以及单体人参皂苷Rg3、Rg5和Rk1的药理作用评价。总皂苷的获取要易于单体皂苷的获取。目前,人参总皂苷、西洋参总皂苷、三七总皂苷等已被证实具有来源丰富、化学成分清晰、药理作用明确等优势,且拥有多靶点、多途径的作用机制。故本论文在综述黑参化学成分、生物活性及急性肝损伤模型的建立等研究进展基础上,综合运用化学成分快速鉴定、特征图谱及特征成分含量测定、代谢组学、网络药理学等多种方法和手段,以黑参为起始原料,首次开展了黑参总皂苷的制备、化学组成及抗急性肝损伤药理作用等三方面的研究,所取得的主要研究成果如下:一、黑参总皂苷制备工艺的研究采用单因素试验和响应面试验,优化了总皂苷的提取、纯化参数,确定了制备工艺为:黑参,粉碎（过二号筛）,加20倍体积的70%乙醇,回流提取3.5小时,过滤,滤液减压回收溶剂,浓缩后的提取液过AB-8大孔吸附树脂柱,水洗至无色,80%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收溶剂,蒸干,即得。采用以上工艺,制备了10批黑参总皂苷,总皂苷含量为76.91%～82.29%。结果表明,所建立的制备工艺具有简单可行、产物含量高的特点。二、黑参总皂苷化学组成及特征图谱的研究1.化学成分快速分析与鉴定采用UPLC-Q/TOF-MS技术结合UNIFI天然产物解析平台,对黑参总皂苷中的化学成分进行了快速分析与鉴定。通过与对照品比对,或通过精确分子量和典型碎片分析,共鉴别出61种化学成分,主要为三萜皂苷类物质。其中,首次从黑参中鉴定的成分有17个,分别是:人参皂苷Ro、F5、F3、Rg8、Re1、Re2、异人参皂苷Rh3、伪人参皂苷RT4、珠子参皂苷F6、F5、F2、三七皂苷R1、R2、（20R）-R2、Fe、20-O-β-D-葡萄糖基人参皂苷Rf以及齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。所鉴定的化学成分丰富了黑参的化学物质研究。2.黑参总皂苷特征图谱的建立采用HPLC-UV法,建立了黑参总皂苷特征图谱,其精密度、重复性、稳定性良好。共指认了9个特征峰,分别为人参皂苷Rb3、Rg6、Rk3、Rg3、（20R）-Rg3、Rk1、Rg5、CK和原人参二醇（PPD）。以人参皂苷Rk1峰为S峰,计算其他特征峰的相对保留时间,其相对保留时间值应在规定值的±5%之内,规定值为:0.77（峰1）、0.84（峰2）、0.88（峰3）、0.95（峰4）、0.96（峰5）、1.00（峰6）、1.01（峰7）、1.02（峰8）、1.10（峰9）。所建立的特征图谱可为黑参总皂苷质量控制与评价提供科学数据与参考。3.黑参总皂苷中特征成分的含量测定建立了9个特征成分的HPLC-UV含量测定方法,其线性范围、精密度、重复性和回收率良好。测定结果表明,10批黑参总皂苷中各特征成分的含量范围分别为:Rg5（14.68%～26.35%）、Rk1（12.82%～28.31%）、PPD（2.28%～4.61%）、CK（1.12%～4.30%）、Rg3（1.14%～3.08%）、（20R）-Rg3（0.52%～1.60%）、Rg6（0.40%～0.85%）、Rk3（0.12%～0.49%）、Rb3（0.17%～0.41%）。通过含量测定,明确了所制备的总皂苷中各特征成分的含量范围。三、黑参总皂苷抗小鼠急性肝损伤作用的研究1.黑参总皂苷对CCl4致小鼠急性肝损伤的影响灌胃给予小鼠黑参总皂苷（15、30、60 mg/kg）5天后,腹腔注射CCl4橄榄油稀释液以建立小鼠急性肝损伤模型,并于造模后3小时、12小时灌胃给药,24小时后取血,测定。数据显示,黑参总皂苷（30、60 mg/kg）可有效降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST、MDA、ROS、IL-6水平;增强血清中SOD、GSH-PX活性;减轻肝组织病变范围与程度,使炎症细胞浸润程度减轻。结果表明,黑参总皂苷可通过减轻炎性反应和增强抗氧化能力而发挥减轻小鼠肝组织损伤的作用。2.整合代谢组学-网络药理学探讨黑参总皂苷抗急性肝损伤的作用机制首先,基于UPLC-Q/TOF-MS的代谢组学技术,筛选出与黑参总皂苷抗急性肝损伤密切相关的色氨酸等代谢物,以及这些代谢物所参与的花生四烯酸代谢等代谢途径。然后,网络药理学研究筛选出对总皂苷抗急性肝损伤贡献较大的人参皂苷Rk1、Rg5、Rh3、Rh4、Rk3等关键成分,STAT3、IL-6等关键靶点,花生四烯酸代谢、PI3K-Akt信号通路等主要代谢通路。最后,通过代谢组学和网络药理学的整合分析,确定了与黑参总皂苷发挥药理作用密切相关的4个代谢物（L-色氨酸、花生四烯酸、核黄素、白三烯A4）、4个关键靶点（IL-6、STAT3、MAPK1、EGFR）、3条代谢途径（花生四烯酸代谢、核黄素代谢、色氨酸代谢）以及5个关键成分（人参皂苷Rk1、Rg5、Rh3、Rh4、Rk3）。3.关键成分与关键靶点的分子对接将5个关键成分（人参皂苷Rk1、Rg5、Rh3、Rh4和Rk3）与IL-6、STAT3、MAPK1、EGFR等4个关键靶点进行分子对接,结果发现,5个皂苷与4个靶点之间均可形成稳定的氢键,结合能为-10.0～-7.0 kcal/mol,表明配体和受体之间具有良好的结合作用。综上所述,本论文首次建立了黑参总皂苷的制备工艺,并制备了10批黑参总皂苷（纯度均＞75%）;鉴定了总皂苷中61种化学成分,含首次从黑参中鉴定的17个成分;建立了总皂苷的特征图谱,并对9个特征峰进行了含量测定;评价了抗急性肝损伤的药理作用;预测出与黑参总皂苷发挥抗急性肝损伤作用密切相关的4个代谢物、4个关键靶点和3条代谢途径;筛选出总皂苷中5个关键成分。本研究为黑参总皂苷皂苷的进一步研究与开发提供了科学数据和理论支持。