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内皮素(endothelin,ET)是从猪动脉内皮细胞培养液中分离出的由21个氨基酸组成的生物活性肽,是目前已知最强的缩血管物质之一。ET主要由内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、上皮细胞、肝细胞、神经细胞、肾小球膜细胞和星形胶质细胞产生。ET家族中有四种异构肽:即ET-1、ET-2、ET-3和ET-4,通过与内皮素受体结合后发挥广泛的生物学活性。大多数学者将ET受体分为ETA,ETB,ETC三种亚型。ETA选择性结合ET-1,主要存在于平滑肌细胞上,激动时介导血管收缩和平滑肌细胞增生;ETB对四种ET异构肽有相近的亲和力,也称为非特异性ET受体,主要分布在心、肺、肾上腺,ETB分为ETB1和ETB2两个亚型,存在于内皮细胞的ETB1受体介导了内皮舒张衍生因子(EDRF)、一氧化氮(NO)、前列环素II(PGI2)的释放,引起血管的舒张,而位于血管平滑肌上的ETB2和ETA一样直接介导静脉血管的收缩;ETC受体是ET-3特异性结合受体,主要分布于神经和外髓肾小管上皮细胞。ET具有广泛的生物学活性,其异常表达参与局部缺血、脑血管痉挛、肾衰、高血压、充血性心力衰竭、急性心肌梗塞、肺动脉高压、转移性前列腺癌等多种疾病的病理生理过程。由于ET参与或加重多种疾病的病理过程,拮抗ET效应将给一些顽固性疾病的治疗带来新的希望,ET受体拮抗剂显然是最为直接有效的方法之一。目前合成开发的ET受体拮抗剂按化学结构可分为肽类和非肽类两大类,按受体选择性的不同又分为ETA受体选择性拮抗剂、ETB受体选择性拮抗剂及非选择性受体拮抗剂。多肽类受体拮抗剂是第一代ET受体拮抗剂,最早发现的肽类拮抗剂有BQ-123,BQ-485与FR-139317,均为选择性ETA受体拮抗剂。此外,非肽类非选择性受体拮抗剂Tezosentan,Bosentan,Enrasentan,SB209670与非肽类ETA选择性受体拮抗剂Sitaxsetan,Ambrisentan,BMS182874,PD156707,A-127722,TBC-3711等也陆续推出。在大量文献调研和参考课题组前期工作的基础上,本课题以肽类内皮素受体拮抗剂BQ-485为先导化合物,并以它的构象研究为依据,进行系统的结构活性研究。在保留先导化合物药效团的基础上,通过改变N端脲基结构,引入非天然氨基酸以及对肽序列中氨基酸结构修饰来改变肽分子的构象限定性、亲水性等性质,以获得新结构类型的肽类受体拮抗剂。通过对所合成的化合物进行生物活性评价,寻求一种既能保持高活性和水溶性,又能减小肌肉注射时带来的皮肤刺激性,减小肝毒副作用,抗酶解的肽类ET受体拮抗剂。本文所设计的肽序列结构通式如下:借鉴ETA受体拮抗剂BQ485肽序列结构与Atrasentan(ABT-627)非脲基结构的研究成果,本文所设计的化合物为:RN-基团为烷基化程度较高的二正丁胺基(DBA);改变N端脲基结构,形成胺乙酰胺非脲基结构;N端氨基酸选用疏水性强的Leu、修饰Leu;第二位氨基酸主要为D-Trp、修饰D(L)-Pro;C末端氨基酸主要为芳香性D-氨基酸:D-Trp、D-(4-Cl)-Phe。在对肽序列氨基酸结构修饰中,本文进行了两方面工作:(1)对N端Leu进行N-烷基化、乙酰化修饰,期望可以提高化合物对氨肽酶的稳定性,延长化合物的半衰期;当AA2为脯氨酸时,将其4位上引入芳香性基团,模拟C端芳香性氨基酸侧链基团,该非肽结构或可提高化合物的抗酶解能力以及改善化合物化学物理性质:引用1H-吲哚-3-乙酰基,模拟D-Trp残基的性质,可能会对拮抗活性产生影响;引入胡椒甲基,由于分子中含有环氧醚键,在增加构象限制性的基础上,会提高其亲水性。(2)基于N端为非脲基结构肽类化合物与N端为脲基结构且AA2为修饰脯氨酸肽类化合物的活性研究,本文在脯氨酸4位上引入吲哚功能基的基础上将肽序列N端脲基结构改构为非脲基基团,期望在保持化合物活性的基础上,增加水溶性,提高抗酶解能力,并减小局部皮肤刺激性。本文所设计的内皮素受体拮抗剂为小肽,且在N端还引入了小分子,为节约氨基酸,同时也为了得到较纯的目标化合物,本文选择了液相合成策略,并选择从N端到C端的顺序缩合。本文合成原料氨基酸8个,并对前期的合成工艺进行了改进,提高了反应效率,所有合成的原料氨基酸经质谱、核磁共振和旋光测定,其结构正确。将所设计及合成的氨基酸构建单元引入到肽序列中,液相法合成了20个新的肽类化合物,所有化合物经中压液相色谱(MPLC)纯化,纯度经HPLC分析,通过质谱与核磁共振对产物进行了鉴定,所有化合物结构正确。本文以文献报道的高活性拮抗剂BQ-485及课题组前期合成的高活性拮抗剂ETP-508为阳性对照,对8个化合物进行了离体组织水平初筛,有6个化合物显示了较高的内皮素受体拮抗活性。活性评价得出以下初步结论:1)N端脲基结构非活性必需基团;2)序列中D-Trp残基是活性必需基团;3)用含吲哚环非氨基酸结构单元可以模拟D-Trp残基的功能,如1H-吲哚-3-乙酰基。同时本文对化合物局部皮肤刺激性与结构的关系进行了初步的探讨:改变N端脲基结构有可能减小或消除局部给药带来的皮肤刺激性。