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乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染,是全球性公共卫生问题。中国是乙肝重灾区,尽管乙肝疫苗的广泛接种明显降低了感染率,但目前仍有近一亿人携带HBV。HBV感染导致肝功能损伤、肝硬化,甚至肝癌,带来巨大的社会负担和经济压力。彻底清除HBV,治疗HBV相关疾病,是我国非常迫切的社会问题。核苷/核苷酸类似物（NUCs,nucleos（t）ide analogs）和干扰素（Interferon,IFN）是治疗乙肝的一线药物,但其存在药物副作用大及病毒耐药等问题,且长期抗病毒治疗后仍难以实现病毒学治愈。因此筛选新的治疗靶点,探索乙肝治疗新方法,具有至关重要的意义。胆固醇-25-羟化酶基因（Cholesterol-25-hydroxylase,CH25H）,是干扰素诱导基因（IFN Stimulated Genes,ISGs）的一员,其编码蛋白胆固醇-25-羟化酶能将胆固醇羟基化为25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol,25HC）。25HC为氧甾醇,可通过激活LXRs及抑制SREBPs活化来调节胆固醇稳态。最新国际研究表明,CH25H及25HC具有广泛的抗病毒作用,能抑制多种病毒复制及感染,包括COVID-19,VSV、HCV、KSHV、EBV、HIV、LASV、ZIKV、HRo V、EBOV、HSV、influenza virus等病毒。但其是否可以调控HBV复制及感染,国际几乎无研究报道。本课题旨在探究CH25H对HBV复制及感染的影响,并探讨其分子生物学机制,并为寻找乙肝治疗药物提供新方向。本课题首先采集了HBV感染患者和健康对照静脉血,分离外周血单个核细胞（PBMCs,Peripheral blood mononuclear cells）后,检测CH25H表达水平。实验发现,HBV患者CH25H m RNA的水平高于健康对照,且HBV刺激健康对照PBMCs 24h能诱导CH25H表达。随后在Hep G2细胞和Huh7细胞中共转染p HBV1.2/p HBV1.3质粒和CH25H野生型、酶活性突变体质粒,通过Elisa、western、q PCR等检测手段检测后,发现CH25H野生型及酶活性突变体均能降低上清中HBe Ag和HBs Ag水平,降低细胞中HBV pg RNA和HBV DNA水平。但是在Hep G2.2.15细胞模型及转染了p HBV1.2质粒的Hep G2细胞系中,加入25HC后,对HBV的复制没有明显的抑制作用或促进作用。以上结果说明CH25H野生行及酶活性突变体均能抑制HBV复制,且CH25H的抗HBV作用并不依赖于其催化产物25HC。随后为了探究CH25H蛋白与HBV编码蛋白之间的相互作用,进行了免疫共沉淀。实验发现CH25H蛋白与HBx蛋白具有相互作用。进一步的免疫荧光共定位、p HBV1.2ΔX质粒转染功能实验和免疫共沉淀实验,证明了HBx蛋白在CH25H的抗病毒作用中起关键作用,且CH25H对HBV的抑制作用,并不是通过经典HBx-DDB1-smc5/6通路来实现的。随后荧光共聚焦及免疫印迹分析,发现了CH25H的作用机制,即CH25H蛋白通过与HBx蛋白相互作用改变HBx蛋白的亚细胞定位,抑制HBx蛋白入核,从而发挥其抑制HBV复制的作用。之后通过CH25H截短突变体与HBx截短体的免疫共沉淀进行功能区鉴定,发现CH25H蛋白与HBx蛋白的C端相互作用,CH25H的TM3结构域在其抗HBV重发挥重要作用。明确了CH25H及25HC对HBV复制的作用后,本课题进一步探究其对HBV感染的影响。本实验应用了HBV感染的经典PHH模型和常用Hep G2-NTCP模型。25HC预处理Hep G2-NTCP细胞/PHH细胞24h后,进行HBV感染实验。出乎意料的是,在两个细胞系中,25HC均能促进HBV感染。接下来本实验采用了CVB3病毒和EV71病毒做对照,25HC预处理Hep G2细胞/293T细胞24h后,感染CVB3/EV71病毒,发现25HC对这两种肠道病毒的感染具有强烈抑制作用。随后为了探究CH25H对HBV感染的影响,本实验用CH25H-WT/Mut慢病毒及Neg慢病毒（对照组）感染Hep G2-NTCP细胞,构建了稳定表达细胞株。随后用构建的细胞模型进行HBV感染实验,发现CH25H野生型和突变体均能抑制HBV感染。CH25H及25HC对HBV复制及感染的双重调控机制,还需要进一步研究。经过研究,本课题得出以下结论:（1）与健康人相比,HBV感染者PBMCs中CH25H m RNA表达较高;（2）CH25H野生型及酶活性突变体均能抑制HBV复制;（3）CH25H对HBV复制的抑制作用不依赖于其催化产物25HC;（4）HBx蛋白在CH25H的抗HBV作用中发挥重要作用;（5）CH25H表达蛋白通过与HBx蛋白相互作用,抑制HBx入核,从而抑制HBV复制;（6）HBx蛋白的C端与CH25H蛋白相互作用;（7）CH25H的TM3结构域在其抗HBV中发挥重要作用;（8）CH25H野生型和突变体均能抑制HBV感染;（9）25HC促进HBV感染。综上所述,本课题利用分子生物学、细胞生物学以及病毒学手段,证明了CH25H对HBV复制及感染的双重调控作用。本课题还揭示CH25H蛋白通过与HBx蛋白相互作用,改变HBx蛋白在细胞内的定位,抑制HBx蛋白入核,从而抑制HBV复制的机制。本研究为HBV的治疗提供有潜力的新途径,并为今后其他病毒的研究起到启示作用。