论文部分内容阅读
背景与目的子痫前期(Pre-eclampsia,PE)是一种严重危害围产期母婴安全的妊娠期特有疾病,主要表现为高血压、蛋白尿。其病因及发病机制尚不明确,临床治疗仍缺乏针对性。目前认为母体免疫功能失调是子痫前期发病过程中的重要环节。而蜕膜来源的间充质干细胞(decidua-derived mesenchymal stem cells,DMSCs)是一类免疫缺陷的成体干细胞,具有高免疫耐受性和低免疫原性,可以通过自分泌与旁分泌作用分泌多种细胞因子,在机体天然免疫和获得性免疫中发挥强大的免疫调节作用。在母胎界面缺血缺氧的情况下,DMSCs能发生一系列适应性的改变,包括数量和功能的变化,其中最显著的变化为细胞迁移能力的改变。而趋化因子CXCL12是由间质细胞和上皮细胞持续分泌的一种趋化蛋白,与其特异性受体CXCR4结合后,能介导下游信号通路在胚胎形成、干细胞动员、肿瘤的迁徙转移中均发挥重要的作用。但是其在子痫前期发病中暂无相关研究报道,本课题拟通过CXCL12/CXCR4轴对PE患者的DMSCs迁移行为改变的研究,进一步明确PE发病的机制,为DMSCs用于PE的治疗提供一定的实验依据。方法1.分离、培养及鉴定蜕膜来源间充质干细胞收集第三军医大学大坪医院产科14例子痫前期患者剖宫产术中的组织标本(蜕膜组织、脐带组织、胎盘组织)和脐带血与外周血标本,为PE组;同样的方法收集正常足月剖宫产孕妇的上述标本,共11例,为正常组。利用Ⅱ型胶原酶消化结合贴壁的方法从蜕膜组织中提取间充质干细胞,并进行传代培养。利用流式细胞术分析自提取细胞的表面标志物(如CD90、CD105、CD44、CD73、CD45、CD34、CD11b、CD19及HLA-DR)的表达情况,并用干细胞三系诱导分化培养基诱导自提取细胞的分化,从而鉴定自提取细胞为蜕膜来源的间充质干细胞。2.CXCL12/CXCR4在子痫前期患者中变化的研究取生长状态良好的第3代DMSCs,用PCR及Western blot方法检测PE患者及正常孕妇DMSCs表达CXCR4及HIF-1α的情况。用免疫组化的方法分析CXCL12在PE患者及正常孕妇的脐带、胎盘、蜕膜组织中的表达情况。此外,利用ELISA方法检测PE患者及正常孕妇脐带血及外周血中的CXCL12。3.CXCL12/CXCR4信号轴介导的DMSCs迁移行为在PE中的改变取生长状态良好的第3代DMSCs,利用transwell小室迁移实验来探讨CXCL12/CXCR4轴是否能介导DMSCs的迁移,并对比PE患者及正常孕妇DMSCs迁移能力的改变;并将transwell小室分别置于21%O2浓度及1%O2浓度的细胞培养箱中培养24h,来探讨缺氧对DMSCs迁移行为的改变。4.统计学方法所有数据经SPSS19.0、Graphpad Prism6.0和Image-Pro plus6.0软件处理,计量资料用平均值±标准差(?x±s)表示,采用独立样本的t检验方法对两组数据进行分析,用单因素方差分析对多组间数据进行分析,用LSD法对组间进行两两比较,认为P<0.05具有统计学差异。结果1.成功从蜕膜组织中提取到间充质干细胞自提取的细胞经过流式细胞术分析其表面标志物,发现CD90(+)、CD105(+)、CD44(+)、CD73(+)、CD45(-)、CD34(-)、CD11b(-)、CD19(-)、HLA-DR(-),符合MSC表面标志物表达情况。经过间充质干细胞三系分化实验显示:所提取到的细胞能够经过诱导分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。因此,我们认为从蜕膜组织中提取到的细胞为间充质干细胞,能够用于后续实验。2.CXCL12/CXCR4在子痫前期患者中变化的研究定量PCR及Western Blot结果显示:PE组DMSCs表达CXCR4及HIF-1α在m RNA及蛋白水平较正常对照组明显增加(P<0.05)。免疫组化实验结果显示:CXCL12在PE患者组织中的表达呈现出蜕膜>胎盘>脐带的浓度梯度,而在正常孕妇组织中表现为脐带>胎盘>蜕膜。而两组孕妇的三种组织比较发现,PE患者蜕膜组织中的CXCL12含量远高于正常组(P<0.05),而脐带与胎盘组织中的CXCL12含量无明显差异。ELISA结果显示:PE患者脐带血中的CXCL12含量明显高于外周血(P<0.05),正常组脐带血与外周血中的CXCL12含量无明显差异(P>0.05),而正常组外周血中的CXCL12含量明显高于PE患者外周血(P<0.05),两组脐带血中的CXCL12含量无明显差异。3.CXCL12/CXCR4信号轴介导的DMSCs迁移行为在子痫前期中的改变transwell小室迁移实验结果显示:DMSCs可以在CXCL12的诱导下发生迁移,而用AMD3100抑制受体CXCR4后,DMSCs的迁移能力明显下降(P<0.05)。PE患者的DMSCs在CXCL12/CXCR4信号轴的介导下,迁移能力较正常对照组明显增强(P<0.05)。而在缺氧环境下,DMSCs的迁移能力较常氧环境下的DMSCs明显下降(P<0.05)。结论1.PE患者蜕膜组织和脐带血中的CXCL12较正常组明显增加,同时PE患者DMSCs中CXCR4的表达也明显高于正常组,这可能与DMSCs迁移能力的改变有关。2.PE患者母胎界面中的CXCL12存在着蜕膜>胎盘>脐带、脐带血>外周血的浓度梯度,与正常孕妇的CXCL12浓度梯度(脐带>胎盘>蜕膜)恰好相反,这样的浓度梯度可能对DMSCs向母胎界面的移动起到一定的作用,为DMSCs应用于PE的治疗提供一定的实验基础。3.DMSCs能够在CXCL12趋化因子的介导下,由低浓度向高浓度处发生迁移,用AMD3100抑制受体CXCR4后,DMSCs的迁移能力明显下降,说明CXCL12/CXCR4轴能够介导DMSCs的迁移。PE患者在常氧及缺氧环境下,迁移能力均明显高于正常对照组DMSCs,说明PE患者的DMSCs能随着CXCL12的浓度梯度大量迁移至蜕膜层中,发挥免疫调节功能,可能在PE的发生、发展中起一定的作用。