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研究背景:既往研究发现NGF/TrkA信号通路在肿瘤的发生、发展以及肿瘤的血管生成、复发、转移等过程中发挥作用,而PI3K/AKT作为该通路的下游信号通路存在于广泛的人类肿瘤谱中,并且近年来大量研究已经证实,在人类的良、恶性肿瘤中NGF/TrkA促进肿瘤细胞增殖、分化的效应与PI3K/AKT信号通路密切相关,然而,关于NGF/TrkA信号通路在椎管内神经鞘瘤发病机制的研究却很少。目的:观察神经生长因子β对椎管内神经鞘瘤细胞增殖的影响及对NGF/TrkA信号通路在椎管内神经鞘瘤中的发病机制进行初步研究。方法:第一步,在无菌条件下收集手术切除的椎管内神经鞘瘤标本,超净工作台中进行组织消化及原代细胞培养,利用雪旺细胞阳性表达S-100蛋白而成纤维细胞阴性表达的原理鉴定椎管内神经鞘瘤细胞的纯度,选择纯度≥95%的细胞作为实验细胞。第二部,将符合纯度要求的椎管内神经鞘瘤细胞用胰酶消化离心配成单细胞悬液,分别以每孔细胞7000个、溶液200 μ L/孔接种于96孔板,对照组只给予体积分数10%FBS·DMEM完全培养基200 μ L,实验组给予体积分数10%FBS·DMEM完全培养基配制的,质量浓度分别为15,30,60,120,240μg/L的神经生长因子β溶液200 μ L,作用24h后,通过MTT法评估细胞增殖情况。按照上述方案,设置对照组:体积分数10%FBS·DMEM完全培养基,实验组分为:①K252a组浓度为100,200,300,400,500,600nmol/L;②LY294002组浓度为10,20,30,40,50,60μmol/L;③神经生长因子β(120μg/L)组;④神经生长因子β(120 μ g/L)+K252a(400nmol/L)组;⑤神 经 生 长 因 子β(120 μ g/L)+LY294002(50 μmol/L)组,作用24h后测定570nm波长处各孔OD值。第三部,在此实验基础上,将椎管内神经鞘瘤细胞接种于96孔培养板中,共接种5个培养板,每板中对照组给予200 μL体积分数10%FBS·DMEM,实验组给予质量浓度为120 μ g/L神经生长因子β溶液200 μL,5板细胞连续培养0,12,24,36,48h后分别用酶标仪测定570nm波长处两组细胞各时间点OD值并绘制生长曲线。第四部,将椎管内神经鞘瘤细胞以每孔5X104细胞接种于6孔板中的4孔,加体积分数10%FBS·DMEM培养基体积至3mL,12h后弃去培养基,对照组给予3mL体积分数10%FBS·DMEM培养基,实验组分别给予神经生长因子β(120 μ g/L)、神经生长因子 β(120 μ g/L)+K252a(400nmol/L)、神经生长因子 β(120 μg/L)+LY294002(50 μ mol/L)培养液各3mL,继续培养24h后,Western blot检测TrkA、AKT、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3 β 蛋白质的表达情况,RT-PCR检测TrkA、AKT蛋白质对应的mRNA表达情况。结果:①与对照组比较,神经生长因子β组细胞吸光值(OD)随神经生长因子β的质量浓度增加而升高(P<0.05),于120 μ g/L时升高幅度最大(P<0.001),K252a、LY294002组细胞0D值不断下降(P<0.05),分别于浓度400 nmol/L、50 μmol/L时下降幅度最大(P<0.001);②神经生长因子β组中TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3 β 蛋白质的表达上调(P<0.05),TrkA mRNA的表达也上调(P<0.05);③神经生长因子 β(120 μg/L)+K252a(400 nmol/L)组细胞0D值下降(P<0.001),TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3 β 蛋白质的表达下调(P<0.05),TrkA mRNA的表达亦下调(P<0.05);④神经生长因子β(120μ g/L)+LY294002(50 μmol/L)组细胞OD值下降(P<0.01),p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达下调(P<0.05);⑤各组中AKT蛋白质及其对应的mRNA的表达无明显变化(P>0.05)。结论:通过本研究可以得出以下结论:1.神经生长因子β能够促进椎管内神经鞘瘤细胞增殖,并且随其浓度的升高,促进细胞增值的作用不断增强。2.神经生长因子β促进椎管内神经鞘瘤时TrkA及对应的mRNA表达上调,AKT及对应的mRNA表达不变,但蛋白质AKT的磷酸化水平增高。3.当神经生长因子β促进鞘瘤细胞增值时,磷酸化糖原合酶激酶3(p-GSK-3 β)的表达水平是增高的。4.椎管内神经鞘瘤发生、发展可能与NGF/TrkA信号转导通路中TrkA、p-AKT(Ther308)及p-GSK-3 β等蛋白质的表达水平有关。