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内生真菌能够提高植物抗生物和非生物胁迫的能力。Verma等人于1998年从印度塔尔沙漠的灌木根上分离得到内生真菌印度梨形抱Piriformospora indica,该菌能够定殖于多种植物的根部,促进植物的生长,显著提高植物对生物和非生物胁迫的抗性。烟草(Nicotiana tabacum)作为生物学研究中重要的模式植物和经济作物,具有易吸收和富集重金属的特点,能够累积在烟株内部,从而影响烟草的生长发育过程和烟叶品质,加重烟叶对人体健康的危害。目前对烟草重金属研究最多的集中在镉(Cd)污染,对烟草重金属汞(Hg)污染的深入研究鲜有报道。本论文从印度梨形孢菌丝体本身对重金属Hg的富集作用,印度梨形孢诱导烟草抗逆相关生理生化指标的变化和重金属Hg胁迫相关基因表达量的变化、诱导烟草Hg胁迫相关蛋白的表达量变化等方面对印度梨形孢降低烟叶Hg含量机理进行初步研究。主要的研究结果如下:1印度梨形孢菌丝体对Hg具有富集作用采用平板试验法研究印度梨形孢菌丝体对重金属Hg的富集作用,结果表明:在含不同浓度Hg的PDA培养基上培养两周后的印度梨形孢菌丝体中重金属Hg的含量均显著高于对照组,表明印度梨形孢菌丝体对Hg具有一定的吸收富集作用。透射电镜观察发现,在Hg处理后,印度梨形孢厚垣孢子的孢子壁变薄,有许多黑色颗粒附着于孢子壁内壁,空泡大小与形状和对照几乎相同,可见印度梨形孢孢子壁对Hg有一定的吸收富集作用;而印度梨形孢菌丝体内液泡增多,内质网上核糖体脱落较多,胞内的脂质体数量明显少于对照,且细胞内部含有许多黑色颗粒物质,分别聚集于细胞壁内侧、液泡内和细胞质中,表明菌丝体细胞壁和液泡对Hg也存在一定的吸附和富集作用。2印度梨形孢在Hg胁迫下对烟草农艺性状的影响水培试验结果表明:浓度为1mg·L-1的Hg处理两周后,接有印度梨形抱的烟草根、茎、叶的干重,茎围、最大叶长和最大叶宽均显著高于未接种烟草;Hg浓度为3mg·L-1时,除烟草茎围差异不显著外,二者间根、茎、叶干重和最大叶长、最大叶宽均达到显著差异;Hg浓度为5mg·L-1时,接与未接印度梨形孢烟草的最大叶宽、茎围的差异不显著,而根、茎、叶干重和最大叶长均达到显著差异,表明印度梨形孢提高了烟草对Hg胁迫的耐受性。3印度梨形孢对烟草根、茎和叶中Hg含量的影响水培试验下,重金属Hg胁迫前,根部接与未接印度梨形孢的烟草的根、茎和叶中Hg含量差异不显著;当用浓度为1.0mg·L·1、3.0mg·L-1和5.Omg·L-1的Hg对烟草处理2周后,接有印度梨形孢的烟草根、茎、叶中Hg的含量均显著低于未接种烟草,这表明,Hg胁迫下,印度梨形孢能够显著降低烟草中的Hg含量,减轻Hg离子对烟草的毒害作用,提高烟草对Hg的耐受性。4 Hg胁迫下印度梨形孢对烟叶抗氧化物质的影响水培实验表明,浓度为3 mg·L-1的Hg分别对烟草处理1、3、9天后,根部接有印度梨形孢的烟叶中叶绿素含量均显著高于未接种的烟草,丙二醛(MDA)含量均显著低于未接种的烟草;3mg.L-1的Hg分别处理6h、12h、24h、48h和72h后,根部接有印度梨形孢的烟叶中过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物气化酶(SOD)活性呈现先升高后降低的趋势,且分别在第6h、6h和24h达到最大值,活性分别是对照烟草的1.1、1.3和1.1倍。同时平板试验研究表明一定浓度重金属胁迫下印度梨形孢菌丝体内这些抗氧化物质增加。表明印度梨形孢可通过增强烟草抗氧化防御能力,清除烟草体内过多的活性氧自由基,维持细胞膜完整性和通透性,进而提高烟草对重金属Hg的耐性。5印度梨形孢对烟草中重金属胁迫相关基因表达量的影响采用RT-PCR分析测定了 Hg胁迫下水培烟草叶中金属硫蛋白基因Ngm、植物熬合肽基因PCS1、烟草生长素抑制蛋白基因ARP1、烟草铁运输相关蛋白基因NtPIC1和热激蛋白基因Hsp90表达情况。3mg.L-1的Hg处理烟草6h、12h、24h、48h和72h后,根部接有印度梨形孢的烟叶中基因Ngm、PCS1、ARP1、NtPIC1和Hsp90的表达量均显著高于未接种烟草,且分别在Hg处理后第6h、12h、12h、24h和24h达到最大值,分别是未接种烟草的2.2、1.8、3.7、2.2和3.7倍。植物螯合肽、金属硫蛋白等参与植物细胞中重金属的解毒作用,其基因表达量的增加能够降低重金属对植物的毒性,从而增强植物对重金属的耐性。6印度梨形孢对烟叶中响应Hg胁迫蛋白表达量的影响运用差异蛋白质组学及生化技术分析Hg胁迫下接有印度梨形孢的烟叶中响应汞胁迫的蛋白表达量变化,发现共有22个重金属胁迫相关蛋白发生显著性差异表达。其中葡糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶(P6)、叶绿体延伸因子、苹果酸脱氢酶、琥珀酸半醛还原酶和肌动蛋白在接有印度梨形孢的烟草中表达下调,而在未接种烟草中表达上调;叶绿体放氧复合体蛋白、光系统Ⅱ反应中心亚单位Ⅱ(P23)放氧复合体、叶绿素b还原酶和PsbQ、铜锌超氧化物歧化酶、半胱氨酸及过氧化氢同工酶等在内的17种蛋白在接有印度梨形孢的烟草中表达上调,而在未接种烟草中表达下调。这些差异蛋白主要参与植物的光合作用和碳代谢、抗氧化防御和解毒、信号传导和次生代谢、能量和其他代谢等过程。这表明印度梨形孢通过诱导这些蛋白质表达量的显著变化,提高植物的光合作用、抗氧化和防御能力等,调节烟草体内信号传导、能量生成和其他代谢蛋白的表达等进而提高烟草对Hg胁迫的耐性。综上所述,印度梨形孢能够通过其菌丝体本身对重金属的富集作用,激活烟草体内抗氧化系统的活性,提高烟草中Hg胁迫相关基因的表达量,诱导烟草中参与光合作用与碳代谢、抗氧化防御与解毒、信号传导与次生代谢、能量和其他代谢等过程的蛋白的表达量变化,提高烟草的生物量,增强烟草对重金属胁迫的抗性,从而降低烟草根、茎、叶中重金属Hg的积累量。