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背景:卵巢癌,是目前世界范围内致死率最高的妇科恶性肿瘤。由于早期的临床症状不显著,大多数的卵巢癌患者被确诊时已是临床晚期,同时,晚期的卵巢癌患者的生存率极低。卵巢癌的早期诊断手段较少,尚且没有完善的检测方法。晚期治疗包括了治疗手段主要有化疗、放疗等方法,但缺乏相关的靶向治疗。因为高特异性的检测手段也无法有效的在人群中侦测到患病,因此很难在人群中做到卵巢癌的检测。多磷酸肌醇4-磷酸酶(inositol polyphosphate 4-phosphatase type,INPP4B)是一种潜在的肿瘤抑制因子,3-磷酸肌醇激酶(PI3K)是肌醇和磷脂酰肌醇的关键激酶,与AKT(蛋白激酶B,PKB)组成PI3K/AKT信号通路,在细胞增殖生长等方面发挥了重要作用。近年来研究有报道指出,INPP4B基因参与了PI3K/AKT通路在乳腺癌和黑色素瘤中的表达。目的:本实验研究INPP4B基因在卵巢癌中的表达,为寻找新的靶点,为卵巢癌在临床治疗上提供出更多的方案。方法:1、实验通过生物信息学TCGA库中筛选人类基因库中356例INPP4B基因的信息,分析对比正常卵巢组织和卵巢癌患者的卵巢组织,研究INPP4B基因在细胞增殖、转移等方面发挥的调控作用。用(Real-time Quantitative PCR)q PCR技术分析了40例临床病例中卵巢癌和正常卵巢组织中INPP4B基因m RNA水平的表达。2、根据目的基因INPP4B的碱基序列及其阴性对照干扰序列,设计特异性sh RNA质粒敲减INPP4B和用GV230质粒过表达INPP4B基因。体外实验通过转染INPP4B基因的干扰技术利用lipofectamin2000脂质体将INPP4B基因表达下调和将INPP4B基因过表达转染到A2780和SKOV-3细胞内,利用Western Blot实验技术,来检测INPP4B基因在卵巢癌细胞中的表达情况。3、克隆形成实验和MTT方法来检验INPP4B基因的不同表达情况下卵巢癌细胞A2780和SKOV-3的增殖生长情况。4、利用流式细胞术和DAPI染色来检测INPP4B基因的不同表达情况下卵巢癌细胞的凋亡情况。用相关的凋亡蛋白来验证其凋亡情况的表达。5、通过细胞划痕实验来验证INPP4B基因的不同表达情况下卵巢癌细胞的转移迁徙情况。用相关的转移蛋白来验证其转移情况的表达。6、利用MTT和细胞克隆形成实验检测INPP4B基因过表达的卵巢癌细胞在顺铂作用后的增殖生长情况。7、利用Western Blot方法来检测目的基因在PI3K/AKT信号通路上的相关蛋白表达情况。结果:1、TCGA数据库得到数据可以发现,利用JuncBASE进行参数设置,筛选出来了正常卵巢组织和卵巢癌组织的INPP4B基因的含量在m RNA表达水进行对比。实验结果分析显示,正常卵巢组织中INPP4B的含量高于卵巢癌卵巢组织的。同时发现随着病情的加重G1-G3期,INPP4B的含量逐渐降低。在5年生存率的结果中可以看出,INPP4B基因高表达的病人的5年生存率高于INPP4B基因低表达的病人。(Real-time Quantitative)PCR结果发现,在m RNA水平上,卵巢癌卵巢组织中的INPP4B的含量低于正常卵巢组织中INPP4B的含量。2、利用转染INPP4B基因的干扰技术,成功获得过表达INPP4B和低表达INPP4B的稳转A2780和SKOV-3的细胞株。Western Blot结果发现,目的基因成功导入到相关细胞系中并准确表达。3、克隆形成实验和MTT方法结果表明,INPP4B基因过表达,抑制肿瘤细胞的增殖,而敲减INPP4B基因后,促进肿瘤细胞的生长。4、流式细胞术和DAPI染色实验结果显示,INPP4B基因过表达,促进卵巢癌细胞的凋亡,而敲减组凋亡数目相对于对照组减少。Western Blot结果显示,INPP4B基因过表达,促凋亡蛋白Caspase9含量增加抗凋亡蛋白BCL-2含量减少。INPP4B基因低表达组促凋亡蛋白Caspase9含量相对阴性对照组减少而抗凋亡蛋白BCL-2含量增加。5、划痕实验结果表明,INPP4B基因的过表达,抑制了细胞的转移,而敲减组则相对于对照组增加了肿瘤细胞的转移。Western Blot结果显示,INPP4B基因过表达,MMP2和MMP9蛋白含量减少,INPP4B低表达组的含量升高。6、MTT和细胞克隆形成实验结果显示INPP4B基因过表达的卵巢癌细胞在顺铂作用后的增殖情况相对于对照组受到了明显抑制作用。7、Western Blot实验结果证实,INPP4B基因的表达参与PI3K/AKT信号通路的调控。结论:卵巢癌细胞的增殖生长和细胞转移受到了INPP4B基因过表达明显的抑制作用,增加了卵巢癌细胞的凋亡。而敲减了INPP4B的表达相对于阴性对照组来说增强其增殖和转移。说明该基因在卵巢癌细胞的增殖生长、转移迁徙和凋亡方面起了至关重要的作用。INPP4B基因作为潜在的抑癌基因,或在卵巢癌的治疗上有了新的思路和方法。