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目的:近年研究认为氧化应激是糖尿病伴牙周炎十分重要的诱因之一。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end product,AGEs)作为2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者机体持久而慢性的高血糖产物,在牙周局部大量产生、积聚后,能通过激活氧化应激、影响细胞信号传导等途径激活宿主的固有免疫系统,引发或放大牙周组织局部的炎性免疫应答,从而诱发或加重牙周炎。但此效应能否导致牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)受损,使其无法及时发挥自我更新和多项分化潜能犹未可知。因此,本实验通过提取、培养健康人来源的PDLSCs,体外模拟单纯牙周炎、糖尿病和糖尿病伴牙周炎的微环境,探索氧化应激可能影响PDLSCs性能的分子机制。方法:本实验主要采用酶解组织块法体外培养正常牙周膜细胞,通过有限稀释法克隆纯化并传代培养得到PDLSCs,经流式细胞术行干细胞表型分子鉴定。通过加载相应刺激(10ng/mL TNF-α和/或100μg/m L AGEs),在体外分别模拟健康牙周(Control组)、单纯牙周炎(TNF-α-PDLSCs组)、2型糖尿病(AGEs-PDLSCs组)和2型糖尿病伴牙周炎(AGEs+TNF-α-PDLSCs组)四种微环境状态(刺激组);另外,采用信号通路抑制剂SP600125(blocker)的预处理进行干预,并分成三个抑制剂组:TNF-α+blocker-PDLSCs组、AGEs+blocker-PDLSCs组和AGEs+TNF-α+blocker-PDLSCs组。(1)以四个刺激组为实验对象:(1)CCK-8法检测细胞增殖;(2)成骨、成脂、成软骨诱导培养基按实验分组,分别添加TNF-α和AGEs后诱导各组PDLSCs 21d,茜素红染色观察各组成骨结节形成情况,碱性磷酸酶染色观察成骨诱导情况,甲苯胺蓝染色观察成软骨诱导情况,油红O染色观察各组脂滴形成情况;(3)成骨、成脂、成软骨按实验分组诱导21d后,用RT-PCR分别检测成骨、成脂、成软骨分化的相关基因表达量。(4)流式细胞术检测各组的ROS水平;(5)检测各组丙二醛(MDA)的生成量;(6)检测各组总超氧化物歧化酶(T-SOD)的生成量;(7)激光共聚焦显微镜检测各组胞浆Ca2+的表达量;(8)流式细胞术检测线粒体膜电位(JC-1)的变化;(9)透射电镜检测PDLSCs线粒体的结构改变。(2)以四个刺激组和三个抑制剂组为实验对象:(1)流式细胞术分别检测各组的细胞凋亡情况;(2)RT-PCR分别检测各组JNK、Cyt-c、caspase-3、Bax和BCL-2的基因表达;(3)Western Blot分别检测各组P-JNK、Cyt-c、caspase-3、Bax和BCL-2的蛋白表达量。结果:牙周膜干细胞分离纯化及鉴定:从牙周膜提取和纯化的PDLSCs均呈长梭状、双极性贴壁生长,形态趋近成纤维细胞,胞浆丰满,胞核位于中心。流式细胞术对第3代PDLSCs行干细胞表型分子鉴定,结果显示第3代PDLSCs的表面抗原分别为STRO-1(6.97±0.012)%、CD146(39.77±0.028)%、CD90(93.10±0.009)%、CD44(83.27±0.050)%,确认了本实验所提取和培养的干细胞来源及其干细胞特性。(1)(1)CCK-8结果显示,TNF-α虽然在一定程度上能促进PDLSCs增殖,但与Control组比较可发现,TNF-α总体上是抑制PDLSCs增殖的,AGEs和AGEs-TNF-α联合作用显著抑制PDLSCs增殖,并且在第3天时抑制作用最强。(2)茜素红染色显示:四组细胞均能诱导形成矿化结节,但Control组的矿化结节体积最大、致密程度高,TNF-α-PDLSCs组的矿化结节体积减小、致密性减弱,AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组的矿化结节体积相对最小且较为分散,致密性低。碱性磷酸酶染色显示:Control组成骨能力最强,TNF-α-PDLSCs组成骨能力减弱,AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组成骨能力显著减弱。甲苯胺蓝染色显示:Control组细胞基质中分泌大量糖胺聚糖,TNF-α-PDLSCs组分泌量较对照组减少,AGEs-PDLSCs组分泌大幅减少,AGEs+TNF-α-PDLSCs组分泌最少。油红O染色显示:Control组胞浆中有大量脂滴形成,TNF-α-PDLSCs组可见少量脂滴,AGEs-PDLSCs和AGEs+TNF-α-PDLSCs组未见脂滴样物质。(3)成骨、成软骨、成脂诱导21d后,各组相关基因的表达均为Control组最高,TNF-α-PDLSCs组、AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组的表达依次降低(P<0.05),AGEs+TNF-α-PDLSCs组比AGEs-PDLSCs组略低,但二者差异无统计学意义(P>0.05)。(2)Control组线粒体内ROS水平最低,三个刺激组的ROS水平都显著增加,尤以AGEs和TNF-α联合作用最甚(P<0.05)。相应的,Control组的T-SOD水平最高、MDA含量最低,三个刺激组的T-SOD水平依次降低而MDA含量依次升高。(3)Control组、TNF-α-PDLSCs组、AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组的PDLSCs胞浆Ca2+水平依次增加,但Control组与TNF-α-PDLSCs组的差异无统计学意义(P>0.05)。胞浆Ca2+超载可间接导致线粒体内Ca2+超载,致使线粒体膜电位去极化,Control组的膜电位远高于三个刺激组,但TNF-α-PDLSCs组与之差异无统计学意义(P>0.05),AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组的膜电位降低剧烈,去极化严重,预示着这两组细胞发生凋亡。AV/PI细胞双染法也印证了AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组细胞凋亡率比Control组和TNF-α-PDLSCs组显著增加,并且相关基因的表达除了抗凋亡蛋白BCL-2依次减少外,其他基因的表达都依次增加,WB印证了这一结果。使用抑制剂SP600125预处理细胞后,三个刺激组的细胞凋亡率都降低,但TNF-α-PDLSCs组与TNF-α+blocker-PDLSCs组的差异无统计学意义(P>0.05),AGEs+TNF-α+blocker-PDLSCs组的降低最为显著,三个抑制剂组和与之对应的刺激组相比,BCL-2的表达依次升高,其他基因的表达都依次降低,WB结果与之佐证。结论:1、AGEs和TNF-α都能抑制PDLSCs的增殖活性和分化能力。2、AGEs对PDLSCs造成的损伤比TNF-α更严重。3、TNF-α和AGEs能诱导PDLSCs发生氧化应激而生成内源性ROS,并导致PDLSCs发生氧化损伤。4、TNF-α和AGEs诱导PDLSCs生成的内源性ROS能激活JNK信号通路。5、JNK的磷酸化激活通过触发线粒体介导的内源性细胞凋亡途径及调控Bax和Bcl-2的表达,诱导PDLSCs发生凋亡。