论文部分内容阅读
目的:近年研究认为氧化应激是糖尿病伴牙周炎十分重要的诱因之一。晚期糖基化终末产物（advanced glycation end product,AGEs）作为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）患者机体持久而慢性的高血糖产物,在牙周局部大量产生、积聚后,能通过激活氧化应激、影响细胞信号传导等途径激活宿主的固有免疫系统,引发或放大牙周组织局部的炎性免疫应答,从而诱发或加重牙周炎。但此效应能否导致牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）受损,使其无法及时发挥自我更新和多项分化潜能犹未可知。因此,本实验通过提取、培养健康人来源的PDLSCs,体外模拟单纯牙周炎、糖尿病和糖尿病伴牙周炎的微环境,探索氧化应激可能影响PDLSCs性能的分子机制。方法:本实验主要采用酶解组织块法体外培养正常牙周膜细胞,通过有限稀释法克隆纯化并传代培养得到PDLSCs,经流式细胞术行干细胞表型分子鉴定。通过加载相应刺激（10ng/mL TNF-α和/或100μg/m L AGEs）,在体外分别模拟健康牙周（Control组）、单纯牙周炎（TNF-α-PDLSCs组）、2型糖尿病（AGEs-PDLSCs组）和2型糖尿病伴牙周炎（AGEs+TNF-α-PDLSCs组）四种微环境状态（刺激组）;另外,采用信号通路抑制剂SP600125（blocker）的预处理进行干预,并分成三个抑制剂组:TNF-α+blocker-PDLSCs组、AGEs+blocker-PDLSCs组和AGEs+TNF-α+blocker-PDLSCs组。（1）以四个刺激组为实验对象:（1）CCK-8法检测细胞增殖;（2）成骨、成脂、成软骨诱导培养基按实验分组,分别添加TNF-α和AGEs后诱导各组PDLSCs 21d,茜素红染色观察各组成骨结节形成情况,碱性磷酸酶染色观察成骨诱导情况,甲苯胺蓝染色观察成软骨诱导情况,油红O染色观察各组脂滴形成情况;（3）成骨、成脂、成软骨按实验分组诱导21d后,用RT-PCR分别检测成骨、成脂、成软骨分化的相关基因表达量。（4）流式细胞术检测各组的ROS水平;（5）检测各组丙二醛（MDA）的生成量;（6）检测各组总超氧化物歧化酶（T-SOD）的生成量;（7）激光共聚焦显微镜检测各组胞浆Ca2+的表达量;（8）流式细胞术检测线粒体膜电位（JC-1）的变化;（9）透射电镜检测PDLSCs线粒体的结构改变。（2）以四个刺激组和三个抑制剂组为实验对象:（1）流式细胞术分别检测各组的细胞凋亡情况;（2）RT-PCR分别检测各组JNK、Cyt-c、caspase-3、Bax和BCL-2的基因表达;（3）Western Blot分别检测各组P-JNK、Cyt-c、caspase-3、Bax和BCL-2的蛋白表达量。结果:牙周膜干细胞分离纯化及鉴定:从牙周膜提取和纯化的PDLSCs均呈长梭状、双极性贴壁生长,形态趋近成纤维细胞,胞浆丰满,胞核位于中心。流式细胞术对第3代PDLSCs行干细胞表型分子鉴定,结果显示第3代PDLSCs的表面抗原分别为STRO-1（6.97±0.012）%、CD146（39.77±0.028）%、CD90（93.10±0.009）%、CD44（83.27±0.050）%,确认了本实验所提取和培养的干细胞来源及其干细胞特性。（1）（1）CCK-8结果显示,TNF-α虽然在一定程度上能促进PDLSCs增殖,但与Control组比较可发现,TNF-α总体上是抑制PDLSCs增殖的,AGEs和AGEs-TNF-α联合作用显著抑制PDLSCs增殖,并且在第3天时抑制作用最强。（2）茜素红染色显示:四组细胞均能诱导形成矿化结节,但Control组的矿化结节体积最大、致密程度高,TNF-α-PDLSCs组的矿化结节体积减小、致密性减弱,AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组的矿化结节体积相对最小且较为分散,致密性低。碱性磷酸酶染色显示:Control组成骨能力最强,TNF-α-PDLSCs组成骨能力减弱,AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组成骨能力显著减弱。甲苯胺蓝染色显示:Control组细胞基质中分泌大量糖胺聚糖,TNF-α-PDLSCs组分泌量较对照组减少,AGEs-PDLSCs组分泌大幅减少,AGEs+TNF-α-PDLSCs组分泌最少。油红O染色显示:Control组胞浆中有大量脂滴形成,TNF-α-PDLSCs组可见少量脂滴,AGEs-PDLSCs和AGEs+TNF-α-PDLSCs组未见脂滴样物质。（3）成骨、成软骨、成脂诱导21d后,各组相关基因的表达均为Control组最高,TNF-α-PDLSCs组、AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组的表达依次降低（P<0.05）,AGEs+TNF-α-PDLSCs组比AGEs-PDLSCs组略低,但二者差异无统计学意义（P>0.05）。（2）Control组线粒体内ROS水平最低,三个刺激组的ROS水平都显著增加,尤以AGEs和TNF-α联合作用最甚（P<0.05）。相应的,Control组的T-SOD水平最高、MDA含量最低,三个刺激组的T-SOD水平依次降低而MDA含量依次升高。（3）Control组、TNF-α-PDLSCs组、AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组的PDLSCs胞浆Ca2+水平依次增加,但Control组与TNF-α-PDLSCs组的差异无统计学意义（P>0.05）。胞浆Ca2+超载可间接导致线粒体内Ca2+超载,致使线粒体膜电位去极化,Control组的膜电位远高于三个刺激组,但TNF-α-PDLSCs组与之差异无统计学意义（P>0.05）,AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组的膜电位降低剧烈,去极化严重,预示着这两组细胞发生凋亡。AV/PI细胞双染法也印证了AGEs-PDLSCs组和AGEs+TNF-α-PDLSCs组细胞凋亡率比Control组和TNF-α-PDLSCs组显著增加,并且相关基因的表达除了抗凋亡蛋白BCL-2依次减少外,其他基因的表达都依次增加,WB印证了这一结果。使用抑制剂SP600125预处理细胞后,三个刺激组的细胞凋亡率都降低,但TNF-α-PDLSCs组与TNF-α+blocker-PDLSCs组的差异无统计学意义（P>0.05）,AGEs+TNF-α+blocker-PDLSCs组的降低最为显著,三个抑制剂组和与之对应的刺激组相比,BCL-2的表达依次升高,其他基因的表达都依次降低,WB结果与之佐证。结论:1、AGEs和TNF-α都能抑制PDLSCs的增殖活性和分化能力。2、AGEs对PDLSCs造成的损伤比TNF-α更严重。3、TNF-α和AGEs能诱导PDLSCs发生氧化应激而生成内源性ROS,并导致PDLSCs发生氧化损伤。4、TNF-α和AGEs诱导PDLSCs生成的内源性ROS能激活JNK信号通路。5、JNK的磷酸化激活通过触发线粒体介导的内源性细胞凋亡途径及调控Bax和Bcl-2的表达,诱导PDLSCs发生凋亡。