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研究背景及目的:研究表明p73基因作为p53基因家族成员之一,在淋巴造血系统肿瘤中发挥抑癌基因作用,肿瘤组织中多为低表达或表达缺失。并且认为该基因的异常表达与基因启动子、外显子区CpG岛的高甲基化有关,而非基因突变的结果。但研究结论多来源于细胞系和急性淋巴细胞白血病资料,涉及恶性淋巴瘤的研究甚少。非霍奇金淋巴瘤(Non- Hodgkin’s lymphoma,NHL)作为恶性淋巴瘤(Malignant lym- phoma,ML)的绝大部分,骨髓浸润(Bone marrow involve- ment,BMI)者临床多见,病情重,发展快,治疗反应差,预后不佳。本实验研究p73基因mRNA在非霍奇金淋巴瘤骨髓浸润标本中的表达及患者p73基因表达缺失与DNA启动子序列甲基化的关系。旨在探讨p73 mRNA基因表达缺失的影响因素、p73 mRNA表达与临床治疗反应的关系以及非霍奇金淋巴瘤骨髓浸润发生发展的可能分子生物学机制。方法:1病例资料经临床、细胞形态学检查及细胞表面抗原标志检查符合NHL诊断的患者28例,男16例,女12例。平均年龄41岁。其中淋巴瘤细胞白血病(Lymphoma cell leukemia,LMCL)7例;B-NHL13例,T-NHL 15例。同期取骨髓形态学检查非肿瘤对照者骨髓8例作为正常对照。2实验方法按常规方法分别采集研究对象骨髓血,分离单个核细胞,应用TRIZOL试剂抽提总RNA,用M-MLV(RNaseH-)、随机引物反转录cDNA第一链,根据NCBI提供基因序列设计并合成引物,采用半定量逆转录聚合酶链反应技术(reverse transcription -PCR,RT-PCR),以看家基因β-肌动蛋白(β-actin)为内参对照,扩增p73基因序列片断。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物p73基因mRNA的表达情况。试剂盒法提取髓血DNA,采用甲基化敏感的限制性内切酶酶切联合多聚酶链反应方法(REP法),分别以未酶切DNA、甲基化敏感酶HapII酶切DNA、甲基化不敏感酶MspI酶切DNA标本为模板,扩增p73基因部分启动子和第一外显子序列,检测其甲基化情况。结合患者的临床资料分析治疗反应与p73 mRNA表达的关系。3统计方法采用四格表资料Fisher确切概率法,分析骨髓浸润非霍奇金淋巴瘤与对照组p73 mRNA基因表达阳性率有无统计学差异;同时采用相同统计方法,分析p73mRNA阴性表达NHL患者初治后总缓解率(remission rate,RR)与p73mRNA阳性表达患者有无统计学差异。采用非参数检验(nonparametric test)Mann-Whitney U检验法分析p73基因不同表达的两组NHL患者间治疗效果有无统计学差异。数据统计使用统计软件SPSS 11.5完成。P<0.05表示差异有显著性意义。结果:1 28例非霍奇金淋巴瘤浸润骨髓标本p73 mRNA阴性表达率为71.4%(20/28),8例非恶性肿瘤对照者骨髓均有p73 mRNA表达,两组p73 mRNA基因表达率差异显著,有统计学意义(P<0.001)。2采用REP法检测所有研究对象在p73基因部分启动子和外显子1的CpG岛甲基化情况,根据甲基化敏感的限制性内切酶HapII可特异性识别CCGG序列,当该序列中的第二个C发生甲基化时,不能切开该序列。而MspI不受甲基化影响切割相同DNA序列。以MspI酶切标本为阴性对照,未酶切标本为阳性对照,检测HapII酶切标本PCR后有无启动子和第一外显子区特异性扩增条带,确定基因调控区高甲基化的情况。所有研究对象DNA标本在甲基化不敏感酶MspI及甲基化敏感酶HapII酶切作用后,PCR扩增产物电泳77bp处均无特异性条带出现,而未酶切DNA标本均存在。说明所有研究对象标本均不能检测到启动子及外显子1高甲基化,提示调控区甲基化与基因表达缺失无相关性。3 p73 mRNA阴性表达的骨髓浸润非霍奇金淋巴瘤患者初治总缓解率40%(8/20)低于阳性表达的非霍奇金淋巴瘤患者87.5%(7/8),经统计学分析差异显著,有统计学意义(P=0.038)。4 p73 mRNA不同表达的两组非霍奇金淋巴瘤患者治疗反应采用Mann-Whitney U检验法(M-W检验)分析(U=2.373,P =0.018),统计数据说明p73 mRNA不同表达NHL患者间,治疗反应差异显著,结合临床资料,提示阳性表达者治疗效果较好。结论:1 p73基因表达缺失与非霍奇金淋巴瘤骨髓浸润的发生、发展密切相关。p73表达缺失的BMI非霍奇金淋巴瘤患者总缓解率明显低于阳性表达患者。p73 mRNA阴性表达(p73基因失活)可作为评估非霍奇金淋巴瘤患者生物学行为、治疗反应及预后的分子标志。2 p73基因部分启动子和第一外显子高甲基化不是非霍奇金淋巴瘤骨髓浸润患者p73 mRNA失表达的主要影响因素。具体机制尚待进一步研究验证。