microRNA (miRNA)是一类小分子非编码RNA,通常为21-25个核苷酸,可与其靶基因的3’-非翻译区互补配对,激活核蛋白复合体miRNAP,对靶mRNA进行切割或翻译抑制,从而参与调控基因表达。miRNA广泛存在于动植物细胞中,与肿瘤关系密切。多数已知的miRNA位于基因组中与肿瘤相关的区域,某些组织特异性miRNA表达图谱的改变可见于直肠结肠癌、肺癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、垂体瘤等多种肿瘤。肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤,Takamizawa等发现肺癌患者的let-7表达显著降低,并且let-7表达水平越低,预后越差,术后生存期越短。体外组织培养实验表明,在人肺癌细胞中瞬时表达let-7可以抑制细胞的增殖。let-7在肺癌的发生发展中作为一个抑癌基因在发挥作用。let-7a2是这个家族的成员之一,其基因定位于染色体11q24.1。1,25-二羟维生素D3 (1,25-(OH)2D3)是维生素D的体内活性形式,能够调节细胞的分化增殖,而这种作用是通过维生素D受体(VDR)介导发挥其生物学效应的。人类VDR基因位于染色体12q13.11,基因全长约4669 bp。VDR蛋白为配体依赖性转录因子,1,25-(OH)2D3通过激活VDR,进而形成VDR/RXR/辅转录因子复合体,与靶基因启动子区域的VDR应答元件(VDRE)识别结合,影响RNA聚合酶Ⅱ介导的某些基因转录,影响细胞的生长、分化、凋亡等过程。1,25-(OH)2D3可降低肺癌细胞系的生长,促进细胞凋亡。VDR属于核转录因子,在肺癌组织中VDR mRNA的表达下调。VDR表达和功能的改变可能导致细胞对1,25-(OH)2D3的反应性变化,而改变对细胞的生长、分化、凋亡等过程的调控。let-7a2在肺癌中作用及表达调控的机制尚未见研究报道,并且在研究let-7a2表达调控时发现,1,25-(OH)2D3可在转录水平上调let-7α2在肺癌细胞A549中的表达,其调控机制及其在肺癌中的作用很有必要进行深入研究。本课题在基因启动子及转录水平研究1,25-(OH)2D3在肺癌中对let-7α2基因表达的调控作用,并初步探讨其调控机制。在此研究中,(1)首先利用5’RACE寻找到let-7α2基因5’上游的转录起始点,进一步通过PCR扩增其5’上游包含启动子的2.8 kb片段(+336 bp至-2523 bp),构建let-7α2的2.8 kb启动子-荧光素酶报道基因质粒并检测其在肺癌A549细胞中的启动子活性。(2)A549细胞经过9-顺维甲酸(9-cis-RA)、全反式维甲酸(AT-RA)、氯化锂(LiCl)、地塞米松(Dex)、1,25-(OH)2D3处理或者分别转染let-7α2启动子-荧光素酶报道基因质粒和let-7α2靶序列-报道基因融合质粒后,经9-cis-RA、AT-RA、LiCl、Dex、1,25-(OH)2 D3处理48 h后,分别通过RT-PCR和荧光素酶活性检测,观察它们对let-7α2在A549细胞中表达的影响。(3)通过构建let-7α2基因5’上游VDR反应元件(VDRE)-绿色荧光蛋白报道基因质粒,转染A549细胞并经1,25-(OH)2 D3处理后,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,了解1,25-(OH)2D3激活VDR转录因子并与VDRE结合,促进报告基因表达的作用。(4)通过电泳迁移率改变实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀分析(ChIP),检测在1,25-(OH)2 D3作用下VDR与VDRE的结合活性。(5)收集18组临床肺癌标本,用RT-PCR方法检测let-7α2和VDR在肺癌组织中表达的相关性。(6)构建let-7α2真核表达质粒,并检测其在肺癌细胞A549中的表达及对A549细胞增殖凋亡的影响。结果：(1)通过5’RACE,确定了let-7α2的转录起始点,并克隆了let-7α2基因5’上游2.8 kb启动子片段,成功构建了let-7α2启动子-荧光素酶报告基因质粒,并且在肺癌细胞A549中显示有启动子活性。(2)9-cis-RA、AT-RA和1,25-(OH)2D3能够增强let-7α2在肺癌细胞中的表达；而LiCl和转录因子CEBPα则使let-7α2在肺癌细胞中的表达降低。(3)1,25-(OH)2 D3能够增强VDRE-绿色荧光蛋白报道基因质粒中绿色荧光蛋白的表达,表明1,25-(OH)2 D3能促进VDR与let-7α2启动子区域中VDRE的结合。(4)EMSA和ChIP鉴定了let-7α2基因上游的VDRE (-1730～-1706 bp),并证实VDRE参与1,25-(OH)2D3对let-7α2基因表达的正向调控作用。(5)在肺癌组织中,let-7α2和VDR mRNA表达密切相关,二者较正常肺组织均降低的占44%(18例中8例),二者表达呈正相关的占67%(18例中12例)。(6)成功构建了let-7α2真核表达质粒,在肺腺癌细胞A549中能有效表达,并且抑制A549细胞增殖,促其凋亡。结论：Iet-7a2与肺癌有密切关系,其在肺癌细胞A549中的表达可能受维甲酸、1,25-(OH)2D3、氯化锂和转录因子CEBPa调控。1,25-(OH)2D3通过VDR与Iet-7a2基因启动子区域中的VDR反应元件结合,发挥对Iet-7a2在肺癌中表达的正向调控作用。这一研究结果为进一步研究Iet-7a2和1,25-(OH)2 D3在肺癌中的作用奠定了基础。