研究目的和背景 2型糖尿病由外周胰岛素抵抗和β细胞功能异常共同引起,后者的作用尤为关键。mTOR信号通路接受上游营养物质及生长因子等的信号,广泛参与细胞生长、增殖及代谢等重要功能的调节。在β细胞中特异性敲除雷帕霉素不敏感mTORC2伴随蛋白Rictor的小鼠(βRicKO小鼠)可出现β细胞总质量及增殖率的减少,同时体外胰岛灌流提示胰岛素分泌降低。证明mTORC2通路的抑制对于β细胞同时存在增殖和分泌功能的影响,但是其中的分子机制仍不明确。mTORC2下游分子信号众多,我们发现Rictor下游新的目标靶蛋白Acsl4,参与细胞内长链脂质代谢,可调控细胞的增殖和线粒体的功能,促进胰岛素分泌。PKCα作为mTORC2另一个下游靶点,受二脂酰甘油和钙调控,调控细胞内囊泡运输过程,也介导mTORC2对胰岛素分泌的促进作用。本研究基于β细胞特异性敲除Rictor小鼠模型,通过体外细胞功能,离体生理实验,运用生物分子学研究手段,尝试验证mTORC2信号通路两个下游分子Acsl4,PKCα对于胰岛β细胞增殖和分泌功能的影响,并阐明他们受mTORC2调控的机制。为了解mTORC2其对β细胞功能调节的作用机制和2型糖尿病发病病理生理过程提供线索。材料和方法 小鼠胰岛素瘤细胞系MIN6上过表达Acsl4的腺病毒,检测增殖、β细胞功能及相关信号通路。利用前期构建的胰岛β细胞上特异Rictor敲除或野生型小鼠,分离其8周、16周野生型WT和βRicKO小鼠的胰岛,从基因转录、蛋白翻译后修饰等方面研究mTORC2调控Acsl4及其影响增殖和分泌的机制,另外,通过在β细胞线粒体数目、基因表达、电势能检测等方面,研究mTORC2/Acsl4对胰岛细胞线粒体稳态平衡。另一方面,通过构建不同突变位点的PKCα腺病毒,通过Western Blot、免疫共沉淀的方法明确mTORC2特异调控PKCα的磷酸化的位点,并在8周胰岛上通过体外病毒转染、体外促泌、ELISA检测胰岛素等方法研究Rictor/PKCα对胰岛功能等方面的调控情况。结果 1、MIN6细胞过表达Acsl4后细胞增殖水平提高,胰岛素分泌得到促进。2、Acs14降低胰岛β细胞内增殖相关分子FoxO1、p27,升高β细胞特异转录因子MafA的蛋白水平。3、βRicKO小鼠胰岛中Acsl4表达下降,包括启动子活性、mRNA及所编码蛋白的表达水平均下降,Acsl4泛素化水平增加。4、过表达Acsl4恢复βRicKO胰岛中增殖缺陷。5、mTORC2/Acsl4通过增强对FoxO1乙酰化的修饰,抑制FoxO1、p27总蛋白量的表达,且该调控独立于Akt Ser473位点的磷酸化。6、胰岛β细胞敲除Rictor组线粒体功能显著下降,自噬功能障碍,低功能线粒体过度堆积,过表达Acsl4可增加线粒体电势。7、在βRicKO胰岛中过表达Acsl4不能恢复在高糖刺激下所造成的胰岛素分泌缺陷。8、过表达PKCα突变位点T638D可恢复βRicKO胰岛对高糖、部分恢复PMA刺激下胰岛素分泌的缺陷。结论 本研究首次发现Acsl4通过调控关键胰岛转录因子FoxO1、p27、MafA等,促进胰岛β细胞的增殖和胰岛素分泌功能。同时,我们发现Acsl4可能是mTORC2调控β细胞增殖的重要的下游靶点。mTORC2可同时影响Acsl4基因的转录水平和蛋白翻译后修饰水平(泛素化)。mTORC2/Acsl4通路通过调控FoxO1乙酰化水平,降低FoxO1的蛋白表达,调控下游增殖相关因子,促进β细胞增殖。其次,mTORC2/Acsl4可影响胰岛线粒体相关功能状态和数量的动态平衡,但是,Acsl4并不能纠正mTORC2活性丢失所导致的胰岛素分泌的下降。相反,mTORC2另一下游靶点PKCα可以恢复βRicKO小鼠β细胞胰岛素分泌水平。mTORC2信号通路对胰岛分泌功能、胰岛β细胞增殖以及线粒体稳态状态的重要作用可能通过不同下游靶点而实现。