解淀粉芽孢杆菌多糖分离纯化及免疫调节作用

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由于人们对解淀粉芽孢杆菌产多糖(polysaccharide from bacillus amyloliquefaciens,BAP)及多糖结构和功能的研究较少,本研究以解淀粉芽孢杆菌为产糖菌株,经发酵制备多糖,并对该多糖进行提取、分离和纯化,研究其理化性质、化学结构以及免疫活性。首先,以解淀粉芽孢杆菌为发酵菌株,经培养、发酵、离心、醇沉、透析、层析等操作,得到纯化的BAP,经高效液相色谱对BAP进行组分测定,结果显示BAP是由两个组分组成。经多糖标样测定,两组分的分子量分别约为6.65 kDa、683.68 kDa;通过MALDI-TOF、紫外、红外、气相等对BAP的结构进行鉴定,测得BAP分子量为5.31 kDa和687.77 kDa,糖含量99.2%,蛋白质含量0.6%,由鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖以及山梨糖(各单糖的摩尔比为0.5:1.2:1.7:2.1:3.7:2.3)组成的,不含糖醛酸、核酸以及蛋白质的具有α-葡萄糖苷键和吡喃糖环结构的中性多糖。其次,采用ABTS、DPPH自由基清除能力和总还原能力(FRAP)方法测定其抗氧化能力,分析结果发现,未加BAP的样品Trolox和FeSO4·7H2O当量值处于较低水平,加入BAP的样品Trolox当量值随着BAP浓度的增大,都表现出上升趋势,当BAP样品浓度达到160 μg/mL时,ABTS、DPPH自由基清除能力的Trolox当量值分别高达753.5、110.5μM,总还原能力的FeSO4·7H2O当量值为1301.5 μM,可以看出在所测定的BAP浓度范围内,Trolox和FeSO4·7H2O当量值与BAP样品浓度之间具有一定的浓度依赖性。再次,MTT和中性红实验以BAP为研究测试样品,将其设置为6个相应的浓度梯度,与RAW264.7细胞联合培养,检测结果表明,相比于空白对照组,BAP均能显著增强细胞活力和吞噬活性,其中80 μL/mL剂量的BAP组,细胞出现活力和吞噬活性最大值,分别为138±1.4%和0.27±0.0.04%。最后,通过测定BAP对RAW264.7细胞免疫因子分泌的影响,证明BAP可以诱导并使RAW264.7细胞激活,来发挥自身免疫调节作用。结果证明在实验组中BAP浓度为80μM时,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)细胞基因的相对表达量出现峰值,分别为5500、3500、3600、2500、7000 pg/mL,而诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)细胞基因的相对表达量与BAP浓度的高低并不存在十分明确的相关性。综上发现,BAP可以显著增大免疫相关基因的表达水平,增强吞噬细胞的免疫功能。
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