羽扇豆多酚分析及其对HepG2细胞氧化应激影响研究

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本文以羽扇豆为原料,进行脱脂,干燥,过筛分级,甲醇提取等工艺提取羽扇豆多酚,体外化学方法对该化合物进行分析,并且测定其抗氧化性,同时用该化合物培养HepG2细胞,检测细胞关于氧化应激和凋亡的指标,为羽扇豆多酚在肝癌的治疗方面提供理论基础。首先,选用羽扇豆粉与正己烷料液比为1:20进行脱脂,进一步用脱脂干燥的羽扇豆粉和50%甲醇以料液比1:10提取羽扇豆中多酚,检测其提取物中脂肪和蛋白质残留量为0,-20℃冰箱保存。羽扇豆多酚采用福林酚法测定总酚的含量,比色法测定黄酮的含量,并且HPLC和LCMS-IT-TOF进一步定性和定量其化合物中特有多酚的种类和含量。采用DPPH自由基清除能力,ABTS自由基清除能力和总抗氧性评价羽扇豆多酚的抗氧化活性,水溶性维生素E(Trolox)做阳性对照。体外细胞实验分析羽扇豆多酚对HepG2细胞氧化应激和凋亡的影响。首先选用时间和药物浓度作为双因素,MTT法检测细胞存活率作为判断指标,筛选双氧水建模IC50和药物干预的最佳浓度。细胞分为3组分别为对照组(完全培养基)、模型组(完全培养基+双氧水)和样品组(样品+双氧水),测定指标分别为超氧化物歧化酶(T-SOD)酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶活力、过氧化氢酶(CAT)酶活力、自由基(ROS)含量、丙二醛(MDA)含量、线粒体膜电位水平、溶酶体膜稳定性、氧化应激和凋亡相关基因的表达量、单细胞凝胶电泳和流式细胞凋亡检测。羽扇豆中酚类化合物含量测定结果:总酚为0.58 mmolGAE/100g;黄酮为1.21 mmol Rutin/100g DM;芹黄素苷含量为57.88 mg vitexin/100 g。羽扇豆多酚的抗氧化性能力测定结果:ABTS自由基清除能力为5.95mmol TE/100g DM;DPPH自由基清除能力为4.23 TE/100 g DM和总抗氧化能力为0.86 mmol TE/100g DM。HepG2细胞实验选择含有终浓度300 μmol/L双氧水的完全培养基,培养时间4h和细胞存活率54.60%,作为HepG2细胞氧化应激模型的条件。含有0.02mg/mL羽扇豆多酚的完全培养基,培养时间48h和细胞存活率为133.17%,作为羽扇豆多酚干预细胞的条件。细胞实验结果分析,与模型组对比,样品组中细胞SOD酶活性增加、ROS和MDA含量降低、线粒体膜电位水平增加、氧化应激相关基因(SOD1、HMOX1、GPX1、GCLC、GCLM、SLC7A11和SRXN1)的表达量增加、凋亡相关基因表达量(CASP9、bcl-2和p53)没有极显著的变化、单细胞凝胶电泳实验细胞都属于轻度损伤和细胞的凋亡数量减少。本文优化羽扇豆多酚的提取工艺,提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力增强,其化合物对HepG2细胞的氧化应激损伤,有很好的保护作用。
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