模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)可通过识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMP)激发固有免疫反应。在这一过程中,PRRs中的保守区域与病原相关分子模式结合被激活,进而诱导Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子表达以实现机体清除病原微生物。环状GMP-AMP合酶(cGAS),作为胞质DNA感受器(sensor),可被外源DNA、损伤细胞释放的DNA、线粒体泄露的DNA以及胞内产生的微核活化,催化产生第二信使2’ 3’-cGAMP,cGAMP进一步激活STING并触发Ⅰ型干扰素(IFN)信号转导。蛋白质的翻译后修饰是蛋白质发挥正常生物学功能的基础,在生命活动中具有十分重要的作用,泛素化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,广泛参与到抗病毒天然免疫信号通路中。但是,蛋白质去泛素调节cGAS激活的机制仍报道较少。本研究中,我们发现去泛素酶USP27X与cGAS相互作用并去泛素化cGAS K48位多泛素链,进而稳定cGAS。敲除或敲低Usp27x的小鼠巨噬细胞中,cGAS蛋白水平显著减少,导致cGAMP产生减少,TBK1和IRF3磷酸化降低,IFN-β表达降低。此外,Usp27x-KO RAW264.7细胞在HSV-1感染下免疫应答受到损伤。以上研究结果表明USP27X是cGAS_STING传感途径的新型调节分子。一研究目的:筛选可特异调控cGAS泛素水平的去泛素化酶(DUB),明确其在抗DNA病毒通路的功能,阐明其作用机制。二研究方法:1.调控cGAS去泛素化的DUB筛选在HEK293T细胞中过表达V5-cGAS和HA-Ub,转染不同家族的去泛素化酶表达载体,使用Anti-V5抗体进行免疫沉淀(immunoprecipitation,IP),western blot检测cGAS泛素化水平,筛选出可调控cGAS去泛素化的DUB。2.CRISPR-cas9系统敲除细胞系构建首先将靶向鼠源Usp27x基因的single guide RNA(sgRNA)构建到载体plenticrispr 中。将测序正确的 plentiCrisprV2-Usp27xsgRNA,同 psPX2,pVSVG按照4:3:2比例转染到HEK293T细胞包装慢病毒。将病毒感染RAW264.7小鼠巨噬细胞,6 h后更换完全培养基,48 h后加入嘌呤霉素(puro)筛选,筛选出敲除Usp27x单克隆细胞,western blot检测敲除效率,比对测序结果确定可敲除Usp27x的克隆株。3.检测USP27X对cGAS的去泛素化作用3.1外源泛素化:在HEK293T细胞中过表达Flag-cGAS和HA-Ub,同时转染Myc-USP27X WT或 Myc-USP27X C87A,Anti-Flag 抗体 IP 富集 cGAS,western blot 检测 cGAS泛素化水平。3.2体外去泛素化检测:在 HEK293T 细胞中过表达 Flag-cGAS 和 HA-Ub,Anti-Flag 抗体 IP 富集 cGAS。体外翻译系统获得的Myc-USP27X或Myc-USP27X C87A重组蛋白与富集的泛素化cGAS混合,37℃孵育60分钟,western blot检测cGAS泛素化水平。3.3内源泛素化:对照RNA(si scramble)或鼠源Usp27x干扰RNA(si Usp27x)转染原代腹腔巨噬细胞,HSV-1刺激后使用Anti-cGAS抗体IP,western blot检测cGAS泛素化。HSV-1 刺激野生型或敲除 Usp27x 的细胞(Usp27x KO RAW264.7),Anti-cGAS抗体IP,western blot检测cGAS泛素化。3.4泛素化类型:将 Flag-cGAS,不同位点突变的 HA-Ub(WT,K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63)和Myc-USP27X的表达载体共同转染到HEK293T细胞中,使用Anti-Flag beads IP,western blot 检测 Flag-cGAS 泛素化水平,确定 cGAS 泛素化类型。4.检测USP27X和cGAS相互作用4.1外源结合在 HEK293T 细胞中转染 Flag-cGAS 和 Myc-USP27X WT 或 Myc-USP27X C87A的表达载体,使用Anti-Flag beads IP,western blot检测两者结合。4.2体外直接结合:体外翻译获得Flag-cGAS和Myc-USP27X WT重组蛋白在IP buffer中共同孵育,Anti-Flag beads 进行 IP,western blot 检测两者结合。4.3内源结合:HSV-1刺激巨噬细胞,Anti-cGAS抗体IP,western blot检测两者结合情况。5.检测USP27X对cGAS稳定性调控5.1稳定性检测:外源梯度过表达 Myc-USP27X WT 或 Myc-USP27X C87A,western blot 检测Flag-cGAS蛋白水平。HSV-1刺激敲低或敲除Usp27x的小鼠巨噬细胞,检测cGAS蛋白水平。5.2半衰期检测:DNA刺激敲除Usp27x小鼠巨噬细胞中,4 h后加入蛋白合成抑制剂(Cycloheximide,CHX)不同时间点收取蛋白,检测cGAS蛋白水平。5.3 cGAS降解方式检测:蛋白酶体抑制剂(MG132)或自噬-溶酶体抑制剂(Chloroquine,CQ)处理Usp27x KO RAW264.7 细胞,HSV-1 刺激不同时间点,western blot 检测 cGAS蛋白表达。6.检测USP27X对天然免疫抗病毒信号通路调控DNA 通路激活剂:HSV-1,ISD,cGAMP 或 RNA 通路激活剂:SeV,Poly(I:C)刺激敲低或敲除Usp27x的巨噬细胞,检测分子磷酸化水平以及IFN-β表达。在Usp27x KO RAW264.7 细胞中表达Usp27x WT或Usp27x C87A,再给予HSV-1刺激后,检测下游TBK1,IRF3磷酸化水平,Ifnbl mRNA以及IFN-β的分泌水平。7.检测USP27X对cGAS合成cGAMP能力影响在WT和Usp27xKO RAW264.7细胞中,转染HSV-60,低渗处理细胞超速离心取上清。上清刺激原代巨噬细胞。裂解细胞提取蛋白加入不含SDS的sample buffer,使用不含SDS的聚丙烯酰胺凝胶检测IRF3二聚化。另外使用cGAMP ELISA试剂盒检测cGAMP含量。8.检测USP27X对天然免疫抗病毒能力的影响HSV-1(MOI=10)刺激 WT或Usp27x KO RAW264.7 细胞,收取上清感染 Vero细胞,通过空斑实验来检测病毒滴度。裂解提取细胞基因组DNA,PCR检测HSV-1 DNA复制情况。另外使用VSV(MOI=0.1)刺激WT或Usp27x KO RAW264.7细胞,收取上清感染Vero细胞,通过空斑实验来检测病毒滴度。裂解并提取细胞RNA,反转录,Real time PCR检测VSV mRNA水平。三实验结果:1.USP27X调控cGAS的去泛素化在HEK293T细胞中过表达V5-cGAS和HA-Ub,转染不同家族的去泛素化酶表达载体,筛选出特异调控cGAS泛素化的DUB:USP27X。为检测USP27X对cGAS调控与其去泛素化酶活性是否相关,将Flag-cGAS和HA-Ub的表达载体转染入HEK293T,同时转染Myc-USP27X或其酶活突变体C87A。结果显示WT USP27x可去泛素化cGAS,但C87A Usp27x无法调控cGAS泛素化,提示USP27X调控cGAS泛素化与其去泛素化酶活性相关。为进一步证明USP27X的去泛素化功能,HSV-1刺激敲低或敲除Usp27x的巨噬细胞,不同时间点收取蛋白检测cGAS泛素化,结果表明敲低或敲除Usp27x明显增加cGAS泛素化。为探究USP27X是否直接去泛素化cGAS,将USP27X WT或USP27X C87A重组蛋白加入到富集的泛素化cGAS中,检测cGAS泛素化。结果提示,USP27X可直接去泛素化cGAS且与其去泛素化酶活性相关。2.USP27X可通过与cGAS相互作用调控cGAS接下来探究USP27X对cGAS去泛素化调控是否通过与其相互作用完成的。首先,我们利用Co-IP检测了 cGAS与USP27X的相互作用,发现在HEK293T细胞中外源过表达的Flag-cGAS和Myc-USP27X相互作用。进一步的内源结合实验证实内源USP27X可与cGAS发生相互作用,且随着刺激时间增加,结合程度明显增强。我们进一步探究两者是否为直接结合,通过体外转录翻译系统获得Myc-USP27X和Flag-cGAS重组蛋白,进行免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation,CO-IP),结果提示,USP27X与cGAS之间为直接结合作用。3.USP27X 可稳定 cGAS3.1 USP27X调控cGAS K48位泛素修饰泛素化调控的具体功能与其调控的泛素化形式相关,接下来我们探究USP27X对cGAS的去泛素化调控形式。我们在HEK293T中转染Flag-cGAS和HA-Ub WT 或其突变体(K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63),同时转染Myc-USP27X,发现cGAS可发生多种多泛素化,但USP27X仅明显切割其K48位泛素链连接。结果提示,USP27X主要调控cGAS K48位泛素化形式。3.2 USP27X调控cGAS蛋白水平为探究USP27X是否参与cGAS的降解过程,在HEK293T细胞中,梯度过表达Myc-USP27X或Myc-USP27X C87A,检测cGAS蛋白水平,结果显示随着USP27X表达水平升高,cGAS蛋白水平明显增加,而USP27X C87A对cGAS蛋白水平无明显调控。另外,我们发现在巨噬细胞中,干扰Usp2 7x可明显降低cGAS的蛋白水平。与此一致,HSV-1刺激敲除Usp27x的巨噬细胞中cGAS蛋白水平明显低于对照组。以上表明,USP27X可调控cGAS蛋白水平。3.3 USP27X 减缓 cGAS 降解为排除USP27X对cGAS转录翻译过程影响,我们进行了半衰期的检测。结果提示,敲除Usp27x组较对照组相比,cGAS蛋白水平明显降低,降解速率明显加快。为探究USP27X调控cGAS降解方式,我们设计了四个组:WT;Usp27x KO RAW264.7;Usp27x KO RAW264.7+MG132:Usp27x KO RAW264.7+CQ。HSV-1刺激不同时间点,检测cGAS蛋白水平。结果表明:USP27X参与调控cGAS自噬溶酶体和蛋白酶体降解。4.USP27X正向调控cGAS介导的DNA信号通路4.1 USP27X正向调控DNA通路信号转导为探究USP27X在固有免疫信号通路中的功能,我们在腹腔巨噬细胞中敲低或敲除Usp27x,结果显示HSV-1和ISD诱导的TBK1,IRF3磷酸化较对照组明显降低,且IRF3二聚化明显降低。但敲低或敲除Usp27x后再以cGAMP刺激细胞,与对照组相比TBK1,IRF3磷酸化无明显差异。为探究USP27X是否影响RLR信号通路转导,使用SeV或poly(I:C)分别刺激不同时间点,检测TBK1和IRF3的磷酸化。结果表明,敲除Usp27x可明显增加SeV或poly(I:C)诱导的TBK1和IRF3的磷酸化。以上结果提示,USP27X可正向调控DNA信号通路,但在RLR信号转导中起负向调节作用。4.2 USP27X缺陷抑制DNA病毒诱导的IFN-β的产生。由于IFN-p的产生是病毒感染宿主的主要效应,为进一步探究USP27X的生理功能,我们检测USP27X在IFN-p信号中的作用。结果显示,敲低或敲除Usp27x显著抑制HSV-1或ISD诱导的Ifnb1 mRNA表达,但对cGAMP诱导的Ifnb1 mRNA无明显调控。我们通过ELISA检测IFN-β分泌水平,结果提示敲低或敲除Usp27x显著抑制IFN-β的分泌,但cGAMP诱导的IFN-β分泌无明显变化。4.3 USP27X可明显拯救Usp27x KO RAW264.7细胞中的信号损伤我们进行了回补实验验证USP27X对DNA信号通路的调控作用。实验分为四个组:WT,Usp27x KO RAW264.7,Usp27x KO RAW264.7+lenti-Usp27x WT;Usp27x KO RAW264.7+lenti-Usp2 7x C87A;结果提示,在Usp2 7x KO RAW264.7细胞中过表达WT Usp27x慢病毒可明显回补TBK1,IRF3的磷酸化水平,但过表达Usp27x C87A慢病毒无明显回补作用。类似地,回补WTUsp27x过表达病毒组,Ifnb1 mRNA水平和蛋白分泌水平均有明显回升,但回补酶活突变型的Usp27x C87A过表达病毒组无明显作用。5.USP27X对cGAS合成酶活性(即合成cGAMP能力)影响cGAMP可作为第二信使激活STING进而触发下游信号通路。因此可通过IRF3的磷酸化和二聚化水平反映cGAS合成酶活性。使用WT或Usp27x KO RAW264.7产生的cGAMP二次刺激巨噬细胞,结果提示,敲除组IRF3磷酸化与二聚化水平明显低于对照组。我们通过在回补实验中使用2’,3’-cGAMP ELISA试剂盒检测cGAMP含量。结果提示,敲除Usp27x,cGAMP合成明显降低,在敲除组过表达野生型的Usp27x病毒,cGAMP合成明显增加,但过表达酶活突变Usp27x C87A病毒,cGAMP合成无明显回升。以上数据表明,USP27X稳定cGAS进而促进cGAMP的合成。6.USP27X抗病毒生理意义因IFN-β与细胞发挥抗病毒功能清除入侵病毒密切相关,为进一步明确USP27X在抗病毒过程中的生理意义,我们进行了抗病毒功能的探究。HSV-1或VSV病毒感染小鼠巨噬细胞,收取细胞上清检测病毒空斑,结果提示,敲低或敲除Usp27x,HSV-1病毒滴度明显增强,VSV病毒受到显著抑制。提取细胞基因组DNA或细胞RNA,检测HSV-1或VSV病毒复制能力,结果表明敲低或敲除Usp27x,HSV-1复制明显增强,VSV复制受到抑制。以上结果表明,USP27X正向调控抗DNA病毒反应,但在抗RNA病毒通路中主要起负向调控作用。四实验结论以及课题创新性1目前对cGAS去泛素化研究较少,且尚未发现直接调控cGAS K48位泛素化的DUB,我们首次发现直接调控cGAS K48位去泛素化的DUB:USP27X,为cGAS功能探究提供新的方向。2 USP27X介导cGAS的去泛素化从而稳定cGAS。3已有文献报道USP27X与细胞凋亡等生命活动相关,但尚未探究其在天然免疫中的功能。我们证实USP27X在抗DNA病毒通路中发挥正向调控作用,增强细胞抗DNA病毒的能力。4病毒感染仍为世界面临的重大问题,且其异变性也增加了临床治疗的难度。HSV-1疱疹病毒在人群中的携带率也非常高,在机体免疫力低下的情况下对人体伤害极大,可诱发口唇疱疹,角膜炎甚至脑炎等,严重危害人类的身心健康。本研究发现USP27X可通过去泛素化cGAS介导IFN-β产生发挥抗病毒功能。表明USP27X可以作为一个新的抗病毒治疗靶标。