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新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的,在家禽和野生鸟类广泛传播的疾病。NDV属于副粘病毒科(Paramyxovirinae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus),为单股负链、不分节段的RNA病毒。真核翻译起始因子2α(Eukaryotic Initiation Factor 2α,eIF2α)Ser51位点磷酸化抑制蛋白翻译起始,是细胞应对各种应激采取的保护策略。例如,细胞发生内质网未折叠蛋白积累,病毒感染,氨基酸饥饿等。宿主细胞内有四种能引起eIF2α磷酸化的激酶:PKR(double-stranded RNA-dependent protein kinase),PERK(PKR-like ER kinase),GCN(general control non-derepressible-2),HRI(heme-regulated inhibitor)。RNA病毒感染细胞,促使干扰素分泌增加,诱导PKR上调表达。病毒增值产生的dsRNA激活PKR,进而磷酸化eIF2α,导致蛋白翻译关闭。大量未折叠蛋白在内质网中积累,GRP78(78 kDa glucose-regulated protein)从PERK解离,PERK发生二聚化并自我磷酸化。活化的PERK磷酸化eIF2α,导致蛋白翻译关闭,进而缓解内质网压力。eIF2α的磷酸化却能促进激活转录因子ATF4(activating transcription factor 4)mRNA翻译,进而增强GADD34(growth arrest and DNA damage-inducible protein 34)表达。蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase 1,PP1)是真核生物主要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,通过催化亚基PP1c与不同调节亚基结合,形成复合体,执行多种多样的生物学功能。其中一个重要调节亚基是GADD34,eIF2α磷酸化时上调表达,帮助PP1去磷酸化eIF2α,从而恢复蛋白翻译。病毒感染通常引起细胞压力应激,并通过磷酸化eIF2α介导感染细胞的蛋白翻译关闭。NDV感染能引起家禽快速死亡,并能选择性杀死人的癌细胞,其具体分子机制尚未清楚。本项目着重于研究NDV调控主细胞蛋白翻译系统的分子机制。嘌呤霉素标记实验表明,在NDV感染前期(0-12小时),人子宫颈癌细胞(HeLa)和鸡成纤维细胞(DF-1)蛋白翻译维持在活跃状态,而在感染后期(12-24小时)蛋白翻译效率逐渐降低。进一步的研究发现,eIF2αSer51位点的磷酸化抑制了蛋白翻译起始,从而降低蛋白翻译效率。Western Blotting实验分析表明,在病毒感染12小时后,eIF2α激酶PKR的表达量上升,并被磷酸化激活;位于内质网上的eIF2α激酶PERK被磷酸化,并被剪切成两个片段。药物抑制实验证明:抑制PKR的活性阻止了eIF2α的磷酸化,而抑制PERK活性对eIF2α的磷酸化没有影响,说明PKR识别病毒复制过程中产生的双链RNA(dsRNA),介导了eIF2α的磷酸化和抑制蛋白翻译关闭。另外,eIF2α高磷酸化水平导致转录因子ATF4被优先翻译,进而上调表达eIF2α磷酸酶PP1的调节亚基GADD34。GADD34能够与PP1结合,水解eIF2αSer51位点的磷酸基团。通过外源表达GADD34,我们证实了GADD34能够降低eIF2α的磷酸化水平,并部分恢复蛋白翻译效率,并有利于病毒蛋白的合成。进一步实验发现,在NDV感染后期,PP1发生降解,从而导致磷酸化的eIF2α累积,抵消了GADD34上调表达带来的蛋白翻译恢复效应,蛋白翻译被持续关闭。综上所述,在NDV感染后期,eIF2α磷酸激酶PKR被上调表达并被磷酸化激活,使得eIF2α被磷酸化。同时,eIF2α磷酸酶PP1被降解,使得eIF2α的去磷酸化处于低水平,最终导致大量磷酸化eIF2α累积,抑制蛋白翻译起始。