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目的体外实验探究PRP与巨噬细胞自噬及炎症因子释放关系;动物体内实验研究自噬在PPR促进糖尿病创面愈合过程中的作用,初步探究其作用机制。方法体外实验采用RAW264.7巨噬实验为研究对象。分为三部分:一、富血小板血浆对巨噬细胞刺激条件筛选:通过CCK-8法及显微镜镜下观察,筛选出PRP最佳计数浓度与刺激比例。二、PRP对巨噬细胞自噬活性变化及其调控自噬对巨噬细胞炎症因子表达的影响研究:使用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)预处理细胞,建立自噬增强/抑制的模型。采用免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白Becl in-1、LC3 II(microtubule-associated protein light chain 3 II)及 P62 的表达;免疫荧光法观察LC3蛋白的荧光聚集情况;酶联免疫印迹法(Enzyme-linled immune sorbent assay,ELISA)检测细胞上清中相关炎症因子TNF-α(tumor necrosis factor-a)、IL-1 β(Interleukin-1 β)、IL-10(Interleukin-10)、TGF-β(Transforming Growth Factor-β)的释放量;Griess偶联反应法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)在细胞上清中的生成与释放量。三、巨噬细胞极化状态下PRP对自噬及炎症因子的影响:通过LPS/IL-4建立巨噬细胞M1/M2模型。采用免疫印迹法检测自噬相关蛋白Beclin-1、P62及LC3 II的表达水平;显微镜下观察RAW 264.7细胞的变化;ELISA法检测炎症相关因子TNF-α、IL-1 β、IL-10、TGF-β及Griess偶联反应法检测NO的生成与释放量。体内实验:四、富血小板血浆通过调控自噬促进糖尿病小鼠创面愈合的机制研究:以BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/NjuII型糖尿病小鼠为研究对象,在其臀背部建立皮肤全层缺损模型。在第3、7、14、21天进行创面皮肤组织取材并采集创面图像,计算其创面愈合率。采用免疫印迹法检测自噬相关蛋白在不同时间点的表达情况;HE染色、Masson染色观察评价创面在不同时间点的愈合情况;免疫组化法观察LC3蛋白在创面组织不同时间点的表达情况。结果一、富血小板血浆对巨噬细胞刺激条件筛选:以不同血小板计数浓度和不同比例PRP刺激RAW 264.7巨噬细胞后,发现计数浓度为1000X 109/L的PRP对细胞增殖率影响最大,为1.298±0.528%,与其余各组相比,有统计学差异;与培养基配比为10%的PRP细胞增殖率最高,为1.275±0.104%,与其余各组相比,具有统计学差异。同时通过显微镜观察发现,10%血小板计数为1000×10VL的PRP,能促进巨噬细胞发生形态改变,细胞从圆形变成不规则、长梭型,并有细长伪足伸出。二、PRP对巨噬细胞自噬活性变化及其调控自噬对巨噬细胞炎症因子表达的影响研究:以自噬抑制剂3-MA干预RAW 264.7巨噬细胞后,细胞自噬水平受到抑制,自噬蛋白Beclin-1、LC3 Ⅱ表达下降,P62表达升高;同时促炎介质(IL-1 β、TNF-α、NO)释放增加。相反,自噬诱导剂RAPA则上调细胞自噬水平,Beclin-1、LC3 Ⅱ表达增加,P62表达降低;并上调了抗炎因子(IL-10、TGF-β)的水平。3-MA/RAPA预处理后加入PRP,均能上调细胞自噬和抑炎因子水平,抑制促炎因子释放。单独加入PRP处理巨噬细胞亦出现相同结果。免疫荧光则显示,RAPA组/RAPA+PRP组/PPR组均可见明显绿色荧光,且与空白组对比,有统计学差异。三、巨噬细胞极化状态下PRP对自噬及炎症因子的影响:显微镜观察发现,在LPS/IL-4/PRP干预下,巨噬细胞性状呈不规则状,且PRP能显著促进细胞增殖。免疫印迹结果显示,LPS/IL-4/PRP均能促进RAW 264.7巨噬细胞自噬。但LPS组、LPS+3-MA组均能上调炎症因子表达水平,与之相反,IL-4/RAPA/PRP则能增加抑炎因子的表达。四、富血小板血浆通过调控自噬促进糖尿病小鼠创面愈合的机制研究:糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型造模结束后,从创面愈合观察计算、HE染色、Masson染色可以得出的结论是(1)正常的BKS-M小鼠组愈合速度最快,愈合情况最佳(炎症消退最快,胶原沉积最多、排列整齐,上皮化完整且见新生血管);(2)空白组与BKS-M组比,愈合速度较慢,愈合情况较差(炎症浸润严重,胶原沉积较少、排列紊乱,上皮角化过度,基本未见新生血管)。(3)PRP组与空白组相比,创面愈合速度加快,愈合情况有所改善(炎症浸润减轻,胶原沉积增多且排列接近正常组织,上皮化趋向正常,可见少量血管生成)。(4)3-MA组与空白组相比,3-MA组愈合速度减慢,创面愈合不良(第21天仍有炎症浸润,组织肿胀且上皮角化过度,胶原沉积较少,未见血管新生)。(5)3-MA+PRP组与3-MA组相比较,其愈合速度加快,创面愈合较3-MA组有所改善。免疫印迹和LC3免疫组化结果则表明,正常的BKS-M小鼠,在创面形成后,自噬水平逐渐上升,第21天有所回降。空白组与之相较,则整体自噬水平较低,但总趋势一致。PRP组与空白组相比,自噬水平上调。3-MA组则出现自噬抑制,但3-MA+PRP组则自噬水平上升。结论1、PRP能促进巨噬细胞增殖且最佳血小板计数浓度为1000×109/L,最佳刺激比例为10%。2、(1)PRP能促进巨噬细胞自噬;(2)PRR能促进巨噬细胞释放IL-10、TGF-β,抑制IL-1 β、TNF-α和NO释放。3、PPR能通过促进极化状态下的巨噬细胞自噬,并上调细胞抗炎因子释放水平。4、自噬在糖尿病创面中发挥重要作用,3-MA抑制自噬后,创面愈合减慢;而PRP能上调创面组织自噬水平,促进炎症进展,创面愈合。综上所述,PRP能通过增强自噬水平,诱导RAW 264.7巨噬细胞增殖,并可能诱导其向M2型极化,释放相关抑炎因子;同时PRP能通过诱导自噬,促进糖尿病创面愈合。