【摘 要】
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目的:肝纤维化是对慢性肝损伤的修复过程,多种病因（包括病毒感染、酒精性肝病、肝炎等等）都会导致肝纤维化这一过程。在肝脏纤维化的过程中,肝星状细胞（HSC）活化发挥着重要作用。Bnip3在细胞中发挥众多调节作用,包括细胞凋亡、细胞死亡（坏死样）、自噬及其特殊形式线粒体自噬。本课题组前期研究发现活化肝星状细胞内Bnip3（Bcl-2/腺病毒E1B-19k Da相互作用蛋白3）与III型中间丝蛋白Vim
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（Hif-1调控自噬影响肝星状细胞脂滴降解和活化的机制研究）（No.81470855）；
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目的:肝纤维化是对慢性肝损伤的修复过程,多种病因（包括病毒感染、酒精性肝病、肝炎等等）都会导致肝纤维化这一过程。在肝脏纤维化的过程中,肝星状细胞（HSC）活化发挥着重要作用。Bnip3在细胞中发挥众多调节作用,包括细胞凋亡、细胞死亡（坏死样）、自噬及其特殊形式线粒体自噬。本课题组前期研究发现活化肝星状细胞内Bnip3（Bcl-2/腺病毒E1B-19k Da相互作用蛋白3）与III型中间丝蛋白Vimentin存在相互作用,调节肝星状细胞自噬与活化。本课题的研究目的是探究Bnip3与Vimentin相互作用的具体结构域,Bnip3与Vimentin相互作用对细胞自噬的调节作用,对Bnip3介导的线粒体自噬机制进行探索,为肝纤维化机制的改善和逆转寻找可能的研究方向。方法:用氯化钴（CoCl2）诱导化学缺氧,刺激人肝星状细胞系LX-2细胞活化,在激光共聚焦显微镜下用免疫荧光染色法观察肝星状细胞中Bnip3和线粒体标记分子Tomm20、内质网标记分子Calnexin、脂滴标记分子ADRP的共定位;使用PCR合成Bnip3和Vimentin不同结构域的截断基因,用p XJ40-HA载体构建Bnip3基因全长和截断的过表达载体,用p XJ40-Flag载体构建Vimentin基因全长和截断的过表达载体;转染过表达质粒于HEK 293T细胞,检测过表达质粒在HEK 293T细胞内的表达情况;在HEK 293T细胞中转染全长Flag-Vimentin（1-1401）和HA-Bnip3（1-585）、HA-Bnip3（1-357）、HA-Bnip3（1-243）过表达质粒,或全长HA-Bnip3（1-585）和Flag-Vimentin（1-1401）、Flag-Vimentin（1-1221）、Flag-Vimentin（1-738）过表达质粒,48h后收集全细胞裂解液,通过Co-IP实验检测Bnip3与Vimentin相互作用的结构域,用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜成像观察Bnip3或Vimentin相应结构域截断突变后对二者共定位的影响;在HEK 293T细胞中共转染Flag-Vimentin（1-1401）和HA-Bnip3（1-585）、HA-Bnip3（1-357）、HA-Bnip3（1-243）过表达质粒,48h后使用自噬激活剂Rapamycin刺激细胞,用Western blot检测Vimentin、Bnip3的表达,用免疫荧光染色和激光共聚焦显微成像技术检测Bnip3（HA抗体）和LC3B的表达和共定位。在HEK 293T细胞中共转染HA-Bnip3（1-585）和Flag-Vimentin（1-1401）、Flag-Vimentin（1-1221）、Flag-Vimentin（1-738）过表达质粒,48h后使用自噬激活剂Rapamycin刺激细胞,用免疫荧光染色和激光共聚焦显微成像技术检测Bnip3（HA抗体）和LC3B的表达和共定位。结果:Bnip3在活化的肝星状细胞系LX-2细胞中表达于线粒体和内质网上;Bnip3TM结构域与Vimentin相互作用,Vimentin Coil2结构域与Bnip3相互作用;Bnip3TM结构域缺失导致Bnip3与自噬小体共定位受到抑制;Vimentin Coil2截断突变细胞中Bnip3与自噬小体共定位受到抑制。结论:在活化肝星状细胞中Bnip3表达于线粒体和内质网,自噬相关蛋白Bnip3 TM结构域和Vimentin Coil2结构域相互作用,Bnip3 TM结构域缺失或Vimentin Coil2结构域截断突变导致Bnip3与自噬小体共定位受到抑制。
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