目的 包装含小鼠FcγRⅡB慢病毒表达载体,观察其在小鼠B细胞表面的表达并研究其抑制性受体对MRL/lpr SLE小鼠的作用研究。方法 将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒调节质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和调节病毒,分别测定表达病毒和调节病毒感染滴度。将MRL/lpr SLE小鼠预防动物(周龄8周左右)40只随机分成病毒液100ul组、病毒液200ul组、预防空病毒组(不含FcγRIIb基因)、预防对照组(生理盐水组)四组,每组10只,再将模型动物(周龄16周左右)组40只随机分成病毒100ul组、200ul组、治疗空病毒组(不含FcγRIIb基因)和治疗对照组(生理盐水组),每组10只。通过尾静脉注射将病毒液转导到MRL/lpr SLE小鼠体内,连续注射四周,每周一次。注射完成后,观察二周后提尾反射法收集小鼠尿液检测小鼠尿蛋白,眼眶內眦静脉取血约500μL后检测小鼠抗核抗体和抗双链DNA含量,取血完成后处死小鼠,取各组小鼠新鲜脾脏组织进行研磨、淋巴细胞分离后再磁珠分选检测B细胞上FcγRIIb基因的mRNA和蛋白的表达并做肾脏、淋巴结、肝脏的病理切片。同时各组的蛋白采用Western blot法和磷酸化Western blot,观察B细胞通路上的Btk、Ship1、Pyn总蛋白和磷酸化蛋白的表达来研究其可能的机制。数据用SPSS16.0软件进行统计学处理,组间比较采用t检验分析,p<0.05为差异具有统计学意义。图表利用Graph Pad Prism 5.0软件绘制。结果1.表达病毒和调节病毒滴度均达106TU/m L。2.MRL/lpr SLEFcγRⅡB m RNA和蛋白表达水平检测结果:预防和治疗空病毒组与对照组相比无意义,病毒组(含100μL和200μL组)与空病毒组相比FcγRⅡB m RNA和蛋白增加。3.MRL/lpr SLE小鼠尿蛋白、抗双链DNA抗体含量检测结果:预防和治疗空病毒组与对照组相比无意义,病毒组(含100μL和200μL组)与空病毒组相比尿蛋白、抗双链DNA含量减少。4.4.1对照组B细胞上的Btk、Lyn与空病毒组相比无意义,预防病毒组中的Btk(含100μL和200μL组)与空病毒组相比蛋白含量明显减少,p<0.01,有统计学意义。预防200μL组Btk总蛋白与100μL组相比明显下降;治疗组B细胞上的Btk各组蛋白无变化。预防病毒组中的Lyn 100μL与空病毒组相比蛋白含量明显增加,p<0.01,有统计学意义;200μL组与100μL组相比明显下降;治疗病毒组中的Lyn100μL组与200μL组相比明显下降。Ship1总蛋白预防和治疗各组无变化。4.2预防空病毒组Btk磷酸化、Lyn磷酸化和Ship1磷酸化水平与对照组比较没有变化。预防病毒200μL组磷酸化Btk、磷酸化Lyn和磷酸化Ship1与空病毒组相比表达水平明显减少,p<0.01,预防病毒100μL组与空病毒组相比无意义。预防病毒200μL组与100μL组相比明显下降。治疗空病毒组Btk磷酸化、Lyn磷酸化和Ship1磷酸化水平与对照组比较没有变化。治疗病毒200μL组磷酸化Btk和磷酸化Ship1与空病毒组相比明显增加,p<0.01,有统计学意义。治疗病毒100μL组磷酸化Lyn与空病毒组相比蛋白含量明显增加,p<0.01,有统计学意义。治疗病毒200μL组与100μL组相比明显升高。5.病理结果A:肾脏:HE染色显示,预防组小鼠肾脏皮质、髓质内广泛性血管充血扩张,周围淋巴细胞浸润;病变肾小球内可见细胞数量增多,体积轻微增大或正常,部分肾小球周围有淋巴细胞浸润。治疗组肾脏皮质、髓质内广泛性血管充血扩张,尤其髓质区和肾小球毛细血管较明显,叶间动脉以及弓形动脉扩张,官腔不整,周围大量淋巴细胞浸润;髓质区弥漫性肾小球轻度增生性改变,病变肾小球内可见细胞数量增多,体积轻微;小球周围多量淋巴细胞浸润,肾小球毛细血管团萎缩,硬化。病毒预防组和治疗组(100μL和200μL)较各自对照组淋巴细胞浸润、弥漫性肾小球增生性改变较轻。B:肝脏:预防组小鼠肝细胞广泛性胞浆疏松化,中央静脉周围多量淋巴细胞浸润,部分区域中央静脉和肝血窦扩张;部分区域汇管区纤维组织增生,小血管扩张并大量淋巴细胞浸润。治疗组小鼠肝细胞广泛性胞浆疏松化,中央静脉周围大量淋巴细胞浸润并分割肝小叶,部分区域中央静脉和肝血窦扩张,小血管扩张并大量淋巴细胞浸润,部分区域病变严重,肝小叶内大量淋巴细胞浸润并分割肝小叶,可见肝细胞点状坏死,肝小叶几乎被淋巴细胞取代,小叶结构破坏。病毒预防组和治疗组(100μL和200μL)较各自对照组淋巴细胞浸润较轻。C:淋巴结:预防组小鼠淋巴结轻度增殖性改变,淋巴结固有结构清晰,淋巴滤泡内多量淋巴细胞,偶见生发中心;模型小鼠淋巴结以增殖性改变为主,主要表现为淋巴小结体积增大,淋巴滤泡增生,大量淋巴细胞增生,部分区域可见多量组织细胞增生,几乎未见生发中心,以至于皮质髓质分界不清,严重病变可见淋巴结固有结构消失。病毒预防组(100μL和200μL)较对照组增生性改变不明显。病毒治疗组(100μL和200μL)较对照组组织细胞增生较少,其中以200μL病毒注射组甚之。结论 成功包装了FcγRⅡB慢病毒表达载体。通过转染到MRL/lpr SLE小鼠体内表达的抑制性受体FcγRⅡB延缓了系统性红斑狼疮小鼠的病理发展过程,上调B细胞上抑制性受体的表达可能是治疗系统性红斑狼疮的一个新途径。