目前已被发现的复制起始蛋白大约有20个,但是DNA复制起始的机制仍然不够清楚.对于酿酒酵母新的DNA复制起始蛋白的筛选与研究,将有助于DNA复制起始机制的深入理解和真核生物复制调控过程的全面阐明.该论文着重介绍一个新的酵母DNA复制起始蛋白的筛选方法.出发菌株经过甲乙硫醚(EMS)诱变之后,如果复制相关基因功能部分缺失,将导致酵母体内只含有一个ARS的质粒无法正常复制而在酵母细胞分裂过程中丢失;但是由于酵母染色体上存在有多个复制起始位点,复制起始频率的降低并不影响其整个基因组的完全复制.这种质粒的丢失,可以通过增加质粒复制起始序列ARS的数量得以挽救.同时,酵母染色体有丝分裂相关基因的突变,也会引起酵母体内质粒的丢失,但这种突变所引起的质粒丢失无法通过增加质粒ARS的数量来挽救.在该筛选中,p1ARS(含1个ARS)和p8ARSs(含8个ARS)被用来区别这两种突变.筛选得到复制起始突变株后,17个带有已知复制起始基因的质粒,被分别转化到这些突变株中,用以排除已知基因的突变.最后,用YCp50构建的酵母基因组文库来克隆未知的新基因.该方法通过酵母菌落颜色表型的变化,来筛选具有复制起始缺陷的突变株.ade2的酵母突变株会在菌体内积累红色中间代谢产物,菌落显红色;ade2 ade3突变株的酵母菌落则呈白色,因为在腺嘌呤的生化合成途径中,ADE3位于ADE2的上游,ADE3的突变使得红色代谢物无法产生.当ade2 ade3突变株体内含有带ADE3基因的质粒,其菌落在选择性平板上则又显红色.而在非选择性平板上,野生型酵母体内质粒的丢失率很低,因而酵母菌落红色的比例很高;在复制起始缺陷的突变株中,质粒的高度丢失使得酵母菌落大部分呈现白色.这种菌落颜色表型的变化,为全面大规模筛选新的复制起始蛋白提供了方便.到目前为止,该筛选从178000个EMS诱变的酵母菌株中,得到464个质粒高丢失候选菌株.通过用p1ARS和p8ARSs进行二级筛选,得到136个质粒高丢失菌株,其中有70个复制起始突变株和66个有丝分裂突变株.经过进一步用已知起始基因的三级筛选,已经发现了24个已知基因突变株和23个未知基因突变株.通过酵母基因组文库克隆到3个可能的复制起始基因:CTF1,CTF3和CTF18.其他未知基因突变株的筛选还在进行.CTF18基因敲除的酵母突变菌株也已经被构建.对于新复制起始基因的筛选和功能研究,不仅会推动酵母DNA复制研究领域的发展,更有助于我们清楚地了解高等真核生物正常以及癌变细胞DNA复制调控的机制.