癌症已经成为世界范围内造成人类死亡的主要疾病,与化学疗法及基因疗法相比,蛋白质疗法在抗癌应用上具有独特的优势,包括药理效力高、特异性强、毒性小、耐药性低以及对正常生物学过程的干扰较小。当蛋白质药物直接用于癌症治疗时,存在稳定性和细胞膜透性差的缺点,这极大地限制了蛋白质药物的应用。因此迫切需要发展一种高效且生物相容性好的载体,促进内涵体逃逸并提高细胞摄取蛋白质药物的能力,以推进蛋白质药物的癌症治疗临床研究。纳米粒子用于蛋白质递送具有如下优点:1)保护蛋白质免受酸性或酶环境的降解或变性;2)延长蛋白质药物的半衰期;3)靶向病变的细胞和组织提高蛋白质药物在临床应用中的安全性和有效性。基于肿瘤微环境的特殊条件,可以设计刺激响应性纳米载体,该载体仅在肿瘤部位通过内源或外源性刺激控制药物的释放,从而将对正常细胞的不良毒性降至最低。本课题利用蛋白质偶联构建了一种刺激响应性纳米粒子,可将核糖核酸酶A（RNase A）高效递送至细胞核中,通过降解核内RNA发挥其抗肿瘤活性,同时也为其他蛋白质药物的核内运输提供了新的递送思路。具体研究工作如下:（1）纳米粒子的制备:通过共价连接将含叠氮基团的刺激响应性Linker偶联在RNase A表面,利用无铜点击反应将含苯并环辛炔的赖氨酸分子（DIBO-Lys）对RNase A进一步偶联,得到带正电荷的单蛋白纳米粒子RNL。还原响应型二硫键可在肿瘤微环境高谷胱甘肽条件下断裂,RNase A以原型形式释放,发挥酶催化和抗肿瘤活性。（2）单蛋白纳米粒子RNL的体外表征:对制备得到的RNL颗粒进行DLS、Zeta电位及TEM一系列表征,结果表明RNL纳米粒子带正电,粒径小于50 nm,这是通过核孔的有效粒径。利用二硫苏糖醇（DTT）模拟了肿瘤高谷胱甘肽的还原性环境,利用琼脂糖凝胶电泳来探究单蛋白纳米粒子RNL的释放,结果显示RNase A可以原型形式快速释放。（3）细胞实验:以小鼠乳腺癌细胞（4T1）来探究纳米粒子RNL在体外的抗肿瘤活性,荧光标记的纳米粒子RNL可在4T1的细胞核内高效聚集。进一步探究其内吞机制显示,RNL依靠的是能量依赖的胞膜窖蛋白介导的内吞,再通过质子海绵效应从溶酶体逃逸,最后通过核转运蛋白介导进入细胞核。体外细胞毒性实验（MTT）结果表明,RNL对小鼠乳腺癌细胞有较强杀伤力。（4）体内实验:通过构建4T1小鼠乳腺癌动物模型,开展动物实验,进一步研究负载上蛋白的RNL在活体水平上的抗肿瘤活性。结果表明RNL能有效抑制肿瘤的增长,同时保证小鼠的体重总体趋于稳定。H＆E组织切片显示RNL没有导致明显的组织损伤,说明其在发挥抗肿瘤活性的同时,有良好的生物安全性。该纳米载体通过核内递送RNase A实现了肿瘤细胞的高效杀伤,体内外实验显示了良好的抗肿瘤效果,为抗癌蛋白的临床研究提供了新的思路。