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研究背景:黑色素瘤是恶性程度最高、预后最差皮肤肿瘤,也是发病率增长最快的肿瘤之一,具有很强的侵袭能力,但目前尚无有效的治疗方法,因而筛选黑色素瘤预后相关的特征基因及构建预后风险模型对黑色素瘤而言十分必要。YTH N6-甲基腺苷（N6-Methyladenosine,m6A）RNA结合蛋白（YTHDF1）属于m6A阅读蛋白,在多种肿瘤的发生发展中作为促癌基因发挥调控作用。Micro RNAs（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA,广泛存在于真核生物体中,参与机体多种生物学过程,miR-195-5p在多种肿瘤细胞中表达异常,作为抑癌基因发挥作用。但是miR-195-5p与YTHDF1在黑色素瘤中如何影响肿瘤的生物学行为,以及二者之间的相互作用,目前尚无文献报道。研究目的:1.确定黑色素瘤中m6A调控基因的遗传标记和预后价值,基于m6A调控基因构建免疫浸润相关的黑色素瘤预后模型。2.明确YTHDF1对黑色素瘤生物学行为的影响,探索miR-195-5p靶向YTHDF1对黑色素瘤细胞增殖、细胞周期进程以及凋亡能力的影响。研究方法:1.从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中获得黑色素瘤患者的m RNA基因表达谱、拷贝数变异（CNV）、单核苷酸多态性（SNP）数据,从GEO数据库中获得黑色素瘤患者的m RNA基因表达谱。通过生物信息学方法分析m6A调控基因在黑色素瘤中的变异情况及其和患者预后的关系,采用多因素回归方法为黑色素瘤患者构建m6A评分模型,通过单因素和多因素Cox分析鉴定该模型的预后价值。基于m6A调控基因表达谱进行无监督聚类分析确定不同临床特征的分子亚型,根据m6A相关特征基因建立新的预后模型,通过测试集和外部验证集确定了该模型的预后价值。2.将GSE112509数据集中样本分为YTHDF1低表达组和YTHDF1高表达组,差异分析确定两组间差异表达基因,并对其进行GO和KEGG通路富集分析,并通过Pearson相关性分析获取与YTHDF1表达密切相关的基因。二者取交集后得到与YTHDF1相关的差异表达基因,构建蛋白互作网络、筛选枢纽基因,确定YTHDF1下游潜在靶基因。利用GEPIA和TCGA数据库分析正常皮肤和黑色素瘤组织间YTHDF1与AURKA的表达差异;Kaplan-Meier方法绘制YTHDF1与AURKA高、低表达状态下患者总体生存曲线。选取黑色素瘤细胞A375,A875与人表皮黑色素细胞HEM-L,运用q RT-PCR与Western blot检验YTHDF1在三种细胞中的表达水平。分别建立YTHDF1过表达和敲低的A375细胞系,运用CCK-8检测细胞的增殖、克隆形成实验检测细胞的集落形成、流式细胞术检测凋亡情况、细胞周期进程,平板划痕实验与transwell侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力;并通过q RT-PCR与Western blot实验检测YTHDF1对AURKA的表达影响。3.利用生物信息学方法确定YTHDF1的上游miRNA,Pearson相关性分析验证二者的表达相关性,应用双荧光素酶报告实验鉴定二者结合能力。在A375,A875与HEM-L细胞中通过q RT-PCR检测miR-195-5p的表达水平。使用miR-195-5p mimics与inhibitor转染A375细胞,应用q RT-PCR与western blot方法,检测miR-195-5p对YTHDF1的表达影响。最后通过miRNA回复实验检测miR-195-5p通过靶向YTHDF1影响细胞增殖,细胞周期进程,与细胞凋亡的过程。研究结果:1.黑色素瘤中m6A调控基因存在着高度的基因组变异,基因组变异频率越高的患者预后越差（p＜0.01）。通过单因素Cox回归分析m6A调控基因的表达,我们发现四种m6A调控基因与患者预后密切相关,分别为:YTHDF1,METTL14,WTAP,RBM15。采用多因素回归方法建立风险评分模型（m6AScore）,单因素与多因素Cox分析结果显示,m6AScore与黑色素瘤患者的预后显著相关。对m6A调控基因表达谱进行无监督聚类分析,鉴定出三个临床类型不同的分子亚组,包括降解增强亚组和免疫增强亚组,它们之间的预后具有显著性差异（p=0.046）。根据差异基因表达谱识别出m6A相关特征基因,并建立新的预后模型,可以有效识别免疫浸润增强的预后不良的样本,并在芯片数据集GSE65904与GSE22153中得到验证。2.生信分析确定AURKA为YTHDF1的下游靶基因,GO和KEGG通路富集分析显示AURKA广泛参与了与细胞增殖、细胞周期相关的过程。通过TCGA和GEPIA数据库分析发现在黑色素瘤组织中YTHDF1与AURKA的表达明显升高。Kaplan-Meier生存曲线分析显示YTHDF1与AURKA高表达的患者相比于低表达患者总体生存率更低。与HEM-L细胞相比,A375,A875中YTHDF1m RNA与蛋白水平明显增高。YTHDF1过表达的A375细胞,其增殖能力增强,细胞周期进程加速,凋亡现象减少,迁移侵袭能力增强;抑制YTHDF1表达的A375细胞,细胞增殖能力被抑制,细胞周期进程被阻滞在G0/G1期,凋亡现象增加,迁移侵袭能力减弱。YTHDF1的过表达可以增加AURKA m RNA与蛋白表达水平,抑制YTHDF1的表达减少了AURKA m RNA与蛋白表达水平。3.生信分析发现miR-195-5p为YTHDF1的上游调控基因,Pearson相关分析显示二者之间为明显负相关,荧光素酶报告实验显示miRNA-195-5p可以直接靶向结合YTHDF1 3’UTR区。A375,A875细胞中miR-195-5p呈现低表达。抑制miR-195-5p能够上调YTHDF1表达,而过表达miR-195-5p则显著抑制了YTHDF1的表达。回复实验证实在A375细胞中miR-195-5p通过靶向YTHDF1抑制细胞增殖与细胞周期的进程,促进细胞凋亡。研究结论:1.黑色素瘤患者中m6A调控基因存在高度变异,其表达水平与变异水平同临床不良预后相关。基于m6A调控基因表达谱对样本进行无监督聚类分析,鉴定出降解增强和免疫增强的分子亚组。根据差异基因表达谱识别出m6A相关特征基因,并建立免疫浸润相关的预后模型。2.皮肤黑色素瘤组织中YTHDF1、AURKA的表达升高,其高表达与黑色素瘤患者临床不良预后密切相关。YTHDF1可能通过AURKA促进黑色素瘤细胞的增殖,加速细胞周期进程,并抑制细胞的凋亡,促进细胞迁移、侵袭,增加黑色素瘤细胞的恶性度。3.miR-195-5p通过调控YTHDF1在黑色素瘤细胞中的表达,抑制黑色素瘤细胞增殖和细胞周期进程,促进细胞凋亡。