【摘 要】
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目的:探讨在食管鳞癌Eca109细胞中生存素（survivin,SVV）参与调控自噬相关蛋白16样蛋白1（autophagy related protein 16 like protein 1,ATG16L1）表达的可能机制。方法:（1）使用雷帕霉素（rapamycin,RAPA）诱导Eca109细胞,应用细胞免疫荧光技术观察诱导后细胞自噬体的数目变化;应用蛋白免疫印迹实验方法检测自噬标志物微管相
【基金项目】
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《Survivin 通过Ikkβ调控食管鳞癌细胞自噬晚期过程的分子机制的研究》（国家自然科学基金;项目编号:81660459）； 广东省粤北人民医院高水平医院建设建设基金；
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目的:探讨在食管鳞癌Eca109细胞中生存素（survivin,SVV）参与调控自噬相关蛋白16样蛋白1（autophagy related protein 16 like protein 1,ATG16L1）表达的可能机制。方法:（1）使用雷帕霉素（rapamycin,RAPA）诱导Eca109细胞,应用细胞免疫荧光技术观察诱导后细胞自噬体的数目变化;应用蛋白免疫印迹实验方法检测自噬标志物微管相关轻链蛋白3（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3）及自噬底物蛋白p62（sequestosome-1,SQSTM1/p62）的蛋白表达水平变化。（2）使用Survivin的特异性抑制剂YM155和Survivin-si RNA作用于细胞自噬模型后,应用蛋白免疫印迹法检测抑制Survivin的表达后对自噬相关蛋白ATG12、ATG5、LC3蛋白表达的影响。（3）应用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）和蛋白免疫印迹实验方法检测雷帕霉素诱导前后Survivin和ATG16L1的基因表达变化;使用Survivin的特异性抑制剂YM155和Survivin-si RNA作用于细胞自噬模型后检测Survivin和ATG16L1的基因表达变化。（4）应用蛋白免疫印迹法和酶活性检测法检测在诱导自噬情况下抑制Survivin后,Cleaved-Caspase-3蛋白和pATG16L1的蛋白表达变化影响以及对Caspase-3酶活性变化的影响。（5）双荧光素酶报告基因实验检测共转染过表达转录因子Survivin载体和p62报告基因质粒后,检测细胞中萤光素酶的表达。（6）在自噬模型中抑制Survivin后,应用蛋白免疫印迹法检测p-NF-κBp65（Thr505）蛋白表达的变化。结果:（1）RAPA诱导Eca109细胞后,与对照组相比,激光共聚焦镜下可观察到细胞内自噬体数目增多,LC3-Ⅱ蛋白的表达量升高,p62蛋白的表达水平降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）与对照组相比,RAPA诱导组中ATG12、ATG5、LC3的蛋白表达量均升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）;使用抑制剂YM155和Survivinsi RNA干预细胞自噬模型后,ATG12和ATG5的蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）,LC3的蛋白表达无明显变化,差异无明显统计学意义（P＜0.05）。（3）与对照组相比,使用抑制剂YM155和Survivin-si RNA干预细胞自噬模型后,RAPA组中Survivin m RNA表达无明显差异（P＞0.05）,ATG16L1m RNA表达升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;当下调Survivin后,Survivin和ATG16L1的m RNA表达均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。（4）与对照组相比,Survivin抑制组中Cleaved-Caspase3蛋白表达水平升高,p-ATG16L1蛋白表达水平降低,Caspase-3酶的活性升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。（5）双荧光素酶报告基因实验结果表明Survivin转录因子能够显著抑制p62的启动子活性（P＜0.05）。（6）与对照组和RAPA组相比,在自噬模型中抑制Survivin后pNFκBp65（Thr505）蛋白磷酸化水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:Survivin可能通过Caspase-3介导的蛋白泛素化降解机制调控ATG16L1的蛋白水平;在自噬的过程中,Survivin对NF-κB的磷酸化位点p65（Thr505）具有正向调控作用,它可能参与了对ATG16L1表达的调控。
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