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FAM76B又称MGC33371,定位于人染色体1 1q21。FAM76B cDNA全长1020bp,编码339个氨基酸。FAM76B蛋白分子在其氨基酸序列151-160aa处是多聚丝氨酸的区域,在167-187aa处是富His的区域,但是现在对FAM76B的具体生物学功能所知甚少。目前已知的与FAM76B有相互作用的蛋白分子有KRTAP4-12。KRTAP4-12蛋白是属于KAP蛋白家族的成员,KAP蛋白是与毛发纤维结构形成有关的蛋白。本实验室以往研究证实,PGRN是另外一种新的与FAM76B相互作用分子。目前研究表明,PGRN与炎症反应、组织修复以及胚胎发育等密切相关;同时PGRN还参与肿瘤血管生成及肿瘤细胞的增殖、浸润等过程。近来研究表明,PGRN基因突变所造成的单倍剂量不足(Haploinsufficiency)也是发生泛素阳性包涵体特征的额颞叶变性(Frontotemporal Lobar Degeneration with ubiquitin-positive inclusions,FTLD-U)的主要因素之一。FAM76B是目前发现的PGRN相互作用的蛋白分子之一,因此研究FAM76B的功能对进一步了解PGRN的功能具有重要的意义。为进一步研究FAM76B的功能,在本课题中采用酵母双杂交技术,筛选与FAM76B相互作用的蛋白分子,在筛选出的分子中,除了出现多次的PGRN蛋白外,MDFIC分子引起了我们的注意,在目前报道的与MDFIC有相互作用的蛋白中,许多蛋白同时也与PGRN有相互作用,如HIV-1 Tat蛋白,cyclinT1蛋白等。之后我们通过免疫共沉淀技术,GST-pull down技术,激光共聚焦显微镜技术进一步验证FAM76B与MDFIC分子的相互作用,最后通过细胞系初步探讨了二者在生物学功能方面的作用。本课题的具体研究内容包括以下几个方面:1.酵母双杂交技术筛选与FAM76B相互作用分子:我们构建了诱饵载体pGBKT7/FAM76B,使用人外周血白细胞cDNA文库筛选与FAM76B相互作用的蛋白。通过测序及初步鉴定发现我们筛选出的多数分子是PGRN,仅有少数其他蛋白分子,其中包括MDFIC。2.FAM76B与MDFIC相互作用的验证:首先利用PCR技术从cDNA文库中克隆了 MDFIC的全长基因,并将其克隆至酵母表达载体中,利用酵母双杂交系统,进一步验证MDFIC与FAM76B的相互作用。然后通过构建MDFIC的不同截短体,并克隆至酵母表达载体中,利用酵母双杂交系统研究MDFIC与FAM76B相互作用部位。结果表明,在FAM76B分子中,与MDFIC相互作用部位位于FAM76B的富含His的区域,在MDFIC分子中,与FAM76B相互作用部位位于MDFIC的I-mfa结构域。之后利用免疫共沉淀技术,GST-pulldown技术验证了这两个蛋白分子在细胞内及体外的相互作用,进一步证明了 FAM76B与MDFIC的相互作用。最后,利用激光共聚焦显微镜技术,研究FAM76B与MDFIC蛋白在CHO细胞内的共定位及分布,结果表明,当FAM76B与MDFIC共转染于CHO细胞时,FAM76B可从细胞核转位于细胞质内,FAM76B与MDFIC分子在细胞内有共定位现象。3.FAM76B与MDFIC介导细胞功能的研究:应用Real-time PCR筛选MDFIC内源性表达的细胞系。结果表明,Hela细胞,U2OS细胞和HepG2细胞的有内源性MDFIC分子的表达。然后以HepG2细胞为模型,通过质粒转染和MTT实验,探讨FAM76B与MDFIC在Axin1抑制细胞生长情况下对HepG2细胞增殖的影响。文献报道MDFIC与Axin1复合体可能存在相互作用,并且在HepG2细胞中高表达Axin1会促进HepG2细胞凋亡,进而抑制细胞的生长。因而推测MDFIC或FAM76B与Axin1蛋白的相互作用会影响Axin1在HepG2细胞中的作用。利用MTT检测方法,通过Axin1与MDFIC或Axin1与FAM76B蛋白的共同表达,研究MDFIC或FAM76B在Axin1抑制细胞生长情况下对细胞生长的影响。研究结果表明,当同时高表达Axin1与MDFICp40蛋白时会进一步抑制细胞的活力。综上所述,本课题获得以下研究结果:(1)用酵母双杂交技术,筛选与FAM76B相互作用的蛋白分子MDFIC;(2)通过免疫共沉淀技术,GST-pulldown技术,激光共聚焦技术方法证实了 FAM76B与MDFIC两蛋白分子的相互作用;(3)利用酵母双杂交系统发现在FAM76B中,与MDFIC相互作用部位坐落在FAM76B富含His区域,在MDFIC中,与FAM76B相互作用部位在MDFIC的I-mfa结构域;(4)应用 Real-time PCR 检测 MDFIC 在 Hela 细胞、U20S 细胞、MCF-7 细胞和 HepG2细胞中的内源性表达,(5)发现当同时高表达Axin1与MDFICp40蛋白时会进一步抑制HepG2细胞的活力。