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目的:近年来,临床常用中药何首乌致药源性肝损伤的报道显著增多,然而其致肝毒性成分及损伤机制至今仍未完全阐明。本研究分别在动物和细胞水平上探讨何首乌中两种活性成分大黄素和二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside,TSG)配伍后在体内外对胆汁酸代谢和肝细胞凋亡的影响。
方法:1.动物水平:84只健康雄性ICR小鼠,于实验室动物房内适应性饲养3d后,随机均分为7d、14d、28d的空白对照组、大黄素组(100 mg/kg)、大黄素配伍低剂量TSG组(大黄素100mg/kg,TSG150mg/kg)和大黄素配伍高剂量TSG组(大黄素100mg/kg,TSG750mg/kg),每组7只,共12组。每日称重后灌胃给予相应的药物,最后一次给药24h后处死ICR小鼠,采集血液和肝脏。分别考察肝功能生化指标变化、肝组织病理学改变、胆汁酸组成与含量差异以及胆汁酸代谢和肝细胞凋亡相关的基因和蛋白的表达水平变化。2.细胞水平:以人正常肝细胞-7702(L-02)作为体外细胞模型,基于细胞增殖抑制评价实验(CCK-8法)确定大黄素给药浓度(低、高浓度分别为10μM、30μM)、TSG配伍倍数(2倍和8倍)和给药后孵育时间(24 h),通过光学显微镜观察、流式细胞术、免疫荧光染色、实时荧光定量PCR和免疫印迹等方法,分别考察不同浓度的大黄素配伍不同倍数的TSG后对L-02细胞的形态学、增殖抑制/凋亡率、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)以及胆汁酸转运代谢和凋亡相关的基因和蛋白表达水平的影响情况。
结果:1.动物水平:(1)行为学观察:给药7天期间各组ICR小鼠毛色光滑油亮,体重增长速率同步,饮食及行动正常,但相比于空白对照组,大黄素组、低剂量配伍组和高剂量配伍组的尿液颜色逐步加深(由浅黄转为淡红色);给药14天后各组ICR小鼠毛色光滑油亮,饮食及行动正常,尿液颜色差异显著且体重增长速率开始出现差异(空白对照组>低剂量配伍组>大黄素组>高剂量配伍组);给药28天后各组ICR小鼠饮食及行动正常,尿液颜色和体重增长速率差异显著(低剂量配伍组≥空白对照组>大黄素组≥高剂量配伍组),除空白对照组ICR小鼠毛色光滑油亮外,其余各组毛色蓬松黯淡无光,并且相比于空白对照组,其余各组ICR小鼠对于外界刺激的敏感度增强。(2)生化指标与病理切片:随着给药时间延长,各给药组肝损伤情况加重(包括ALT、AST升高,肝脏系数降低等),但相比于大黄素组和高剂量配伍组,低剂量配伍组表现出一定的肝保护效应。在胆汁淤积指标方面,各给药组肝脏呈现先加重后减轻趋势;H&E染色与TUNEL染色结果显示,肝组织损伤和肝细胞凋亡具有明显的时间依赖性,且TSG配伍大黄素使损伤情况加重,但无显著的剂量依赖性。(3)胆汁酸成分变化:基于主成分分析(PCA)的结果表明,给药7天时药物干预未能引起胆汁酸组成显著改变,给药14天时各组的胆汁酸组成产生了显著变化,而给药28天时,各组的胆汁酸组成情况具有向一致性转化的趋势;基于正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)的结果,我们发现在不同给药时间和给药模式下两种胆汁酸即α-鼠胆酸(α-MCA)和猪胆酸(HCA)存在显著性差异,其具有潜在生物标志物的可能性。(4)基因和蛋白表达水平(肝组织):随着给药时间延长,各给药组胆汁酸转运代谢相关基因和蛋白FXR、SHP、BSEP、MRP2和MRP3的整体表达水平先降低后升高,从整体胆汁酸稳态平衡调节的角度看,低剂量的TSG配伍减轻了大黄素诱导的胆汁酸紊乱,而高剂量的配伍反之;凋亡方面,各给药组凋亡抑制基因(蛋白)BCL-2时间依赖性下调,促凋亡基因(蛋白)BAX时间依赖性上调,给药7天时各实验组caspase-3剪切不显著,给药14天和28天时,各给药组caspase-3剪切增多,并且出现了给药7天时未出现的PARP-1剪切。值得注意的是,低剂量配伍组在给药早期延缓了大黄素致肝细胞凋亡的进程,但在给药后期还是加重了肝细胞凋亡程度(高剂量配伍组>低剂量配伍组>大黄素组>空白对照组)。2.细胞水平:(1)细胞形态学观察与免疫荧光染色:观察结果显示,当给予低浓度大黄素(10μM)时,配伍低/高倍数的TSG均抑制其诱导的细胞凋亡,当给予高浓度大黄素(30μM)时,配伍低/高倍数的TSG浓度依赖地加重其诱导的细胞凋亡。(2)细胞凋亡率与MMP:流式结果表明,低倍数TSG配伍大黄素使凋亡率减少,并且逆转大黄素所致MMP降低,高倍数TSG配伍尽管同样升高了MMP,但凋亡率有所增加;高浓度大黄素干预的细胞多进入凋亡晚期,凋亡率及MMP均与TSG配伍浓度正相关。(3)基因和蛋白表达水平(L-02):TSG几乎不参与FXR和BSEP的直接调控,但可以上调SHP、MRP2和MRP3的表达水平,当配伍低/高浓度的大黄素时,分别浓度依赖地下调/上调CYP7A1和NTCP的表达水平。从整体胆汁酸稳态平衡调节的角度看,TSG配伍低浓度大黄素浓度依赖地减少胆汁酸的合成摄取,同时增加了胆汁酸的外排,而TSG配伍高浓度的大黄素则反之;凋亡方面,TSG可以上调BCL-2的表达水平,在配伍低/高浓度大黄素时分别浓度依赖地下调/上调BAX的表达水平,显著性Caspase-3剪切出现在高倍数TSG配伍低/高浓度的大黄素中,且给予高浓度大黄素干预的实验组均显示较深的caspase-3剪切的免疫印迹。
结论:何首乌所致药源性肝损伤与其含有的两种活性成分TSG和大黄素的相对含量相关;大黄素所致胆汁酸代谢紊乱加剧其诱导的肝细胞凋亡,其中,胆汁酸合成转运代谢关键核受体FXR及其下游调控对象SHP在该损伤过程中可能发挥了关键性作用。本研究为生首乌的“炮制减毒”提供解释,也为中药何首乌提取物及其单体成分大黄素在体内外产生不同的药理作用提供了一定的理论依据。
方法:1.动物水平:84只健康雄性ICR小鼠,于实验室动物房内适应性饲养3d后,随机均分为7d、14d、28d的空白对照组、大黄素组(100 mg/kg)、大黄素配伍低剂量TSG组(大黄素100mg/kg,TSG150mg/kg)和大黄素配伍高剂量TSG组(大黄素100mg/kg,TSG750mg/kg),每组7只,共12组。每日称重后灌胃给予相应的药物,最后一次给药24h后处死ICR小鼠,采集血液和肝脏。分别考察肝功能生化指标变化、肝组织病理学改变、胆汁酸组成与含量差异以及胆汁酸代谢和肝细胞凋亡相关的基因和蛋白的表达水平变化。2.细胞水平:以人正常肝细胞-7702(L-02)作为体外细胞模型,基于细胞增殖抑制评价实验(CCK-8法)确定大黄素给药浓度(低、高浓度分别为10μM、30μM)、TSG配伍倍数(2倍和8倍)和给药后孵育时间(24 h),通过光学显微镜观察、流式细胞术、免疫荧光染色、实时荧光定量PCR和免疫印迹等方法,分别考察不同浓度的大黄素配伍不同倍数的TSG后对L-02细胞的形态学、增殖抑制/凋亡率、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)以及胆汁酸转运代谢和凋亡相关的基因和蛋白表达水平的影响情况。
结果:1.动物水平:(1)行为学观察:给药7天期间各组ICR小鼠毛色光滑油亮,体重增长速率同步,饮食及行动正常,但相比于空白对照组,大黄素组、低剂量配伍组和高剂量配伍组的尿液颜色逐步加深(由浅黄转为淡红色);给药14天后各组ICR小鼠毛色光滑油亮,饮食及行动正常,尿液颜色差异显著且体重增长速率开始出现差异(空白对照组>低剂量配伍组>大黄素组>高剂量配伍组);给药28天后各组ICR小鼠饮食及行动正常,尿液颜色和体重增长速率差异显著(低剂量配伍组≥空白对照组>大黄素组≥高剂量配伍组),除空白对照组ICR小鼠毛色光滑油亮外,其余各组毛色蓬松黯淡无光,并且相比于空白对照组,其余各组ICR小鼠对于外界刺激的敏感度增强。(2)生化指标与病理切片:随着给药时间延长,各给药组肝损伤情况加重(包括ALT、AST升高,肝脏系数降低等),但相比于大黄素组和高剂量配伍组,低剂量配伍组表现出一定的肝保护效应。在胆汁淤积指标方面,各给药组肝脏呈现先加重后减轻趋势;H&E染色与TUNEL染色结果显示,肝组织损伤和肝细胞凋亡具有明显的时间依赖性,且TSG配伍大黄素使损伤情况加重,但无显著的剂量依赖性。(3)胆汁酸成分变化:基于主成分分析(PCA)的结果表明,给药7天时药物干预未能引起胆汁酸组成显著改变,给药14天时各组的胆汁酸组成产生了显著变化,而给药28天时,各组的胆汁酸组成情况具有向一致性转化的趋势;基于正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)的结果,我们发现在不同给药时间和给药模式下两种胆汁酸即α-鼠胆酸(α-MCA)和猪胆酸(HCA)存在显著性差异,其具有潜在生物标志物的可能性。(4)基因和蛋白表达水平(肝组织):随着给药时间延长,各给药组胆汁酸转运代谢相关基因和蛋白FXR、SHP、BSEP、MRP2和MRP3的整体表达水平先降低后升高,从整体胆汁酸稳态平衡调节的角度看,低剂量的TSG配伍减轻了大黄素诱导的胆汁酸紊乱,而高剂量的配伍反之;凋亡方面,各给药组凋亡抑制基因(蛋白)BCL-2时间依赖性下调,促凋亡基因(蛋白)BAX时间依赖性上调,给药7天时各实验组caspase-3剪切不显著,给药14天和28天时,各给药组caspase-3剪切增多,并且出现了给药7天时未出现的PARP-1剪切。值得注意的是,低剂量配伍组在给药早期延缓了大黄素致肝细胞凋亡的进程,但在给药后期还是加重了肝细胞凋亡程度(高剂量配伍组>低剂量配伍组>大黄素组>空白对照组)。2.细胞水平:(1)细胞形态学观察与免疫荧光染色:观察结果显示,当给予低浓度大黄素(10μM)时,配伍低/高倍数的TSG均抑制其诱导的细胞凋亡,当给予高浓度大黄素(30μM)时,配伍低/高倍数的TSG浓度依赖地加重其诱导的细胞凋亡。(2)细胞凋亡率与MMP:流式结果表明,低倍数TSG配伍大黄素使凋亡率减少,并且逆转大黄素所致MMP降低,高倍数TSG配伍尽管同样升高了MMP,但凋亡率有所增加;高浓度大黄素干预的细胞多进入凋亡晚期,凋亡率及MMP均与TSG配伍浓度正相关。(3)基因和蛋白表达水平(L-02):TSG几乎不参与FXR和BSEP的直接调控,但可以上调SHP、MRP2和MRP3的表达水平,当配伍低/高浓度的大黄素时,分别浓度依赖地下调/上调CYP7A1和NTCP的表达水平。从整体胆汁酸稳态平衡调节的角度看,TSG配伍低浓度大黄素浓度依赖地减少胆汁酸的合成摄取,同时增加了胆汁酸的外排,而TSG配伍高浓度的大黄素则反之;凋亡方面,TSG可以上调BCL-2的表达水平,在配伍低/高浓度大黄素时分别浓度依赖地下调/上调BAX的表达水平,显著性Caspase-3剪切出现在高倍数TSG配伍低/高浓度的大黄素中,且给予高浓度大黄素干预的实验组均显示较深的caspase-3剪切的免疫印迹。
结论:何首乌所致药源性肝损伤与其含有的两种活性成分TSG和大黄素的相对含量相关;大黄素所致胆汁酸代谢紊乱加剧其诱导的肝细胞凋亡,其中,胆汁酸合成转运代谢关键核受体FXR及其下游调控对象SHP在该损伤过程中可能发挥了关键性作用。本研究为生首乌的“炮制减毒”提供解释,也为中药何首乌提取物及其单体成分大黄素在体内外产生不同的药理作用提供了一定的理论依据。