【摘 要】
:
ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是主要由小白链霉菌(Streptomyces albulus)产生的一种具有广谱抑菌活性的次级代谢产物,作为一种新型天然食品防腐剂在食品工业领域获得了广泛应用。因此,选育优良的ε-PL产生菌提高ε-PL生产发酵效率并降低生产成本显得格外重要。通过传统的育种方式选育ε-PL高产菌株已经达到了瓶颈,故利用代谢工程手段提高ε-PL生产菌的产物合成能
论文部分内容阅读
ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是主要由小白链霉菌(Streptomyces albulus)产生的一种具有广谱抑菌活性的次级代谢产物,作为一种新型天然食品防腐剂在食品工业领域获得了广泛应用。因此,选育优良的ε-PL产生菌提高ε-PL生产发酵效率并降低生产成本显得格外重要。通过传统的育种方式选育ε-PL高产菌株已经达到了瓶颈,故利用代谢工程手段提高ε-PL生产菌的产物合成能力是降低ε-PL生产成本的有效手段。然而,目前有关ε-PL生物合成的关键代谢节点和调控机制却较少被探讨。论文以S.albulus WG-608为研究对象,以高低产菌的代谢流量分析为研究基础,挖掘潜在的ε-PL生物合成关键基因;对潜在关键基因进行过表达,确定了三个有效的基因ppc、pyc和pls;将ppc、pyc和pls进行组合过表达,并利用代谢流分析确定过表达元件的效能。以下为主要研究内容和结果:(1)对ε-PL产生菌株S.albulus M-Z18和高产菌株S.albulus WG-608进行代谢流分析,分析限制WG-608的ε-PL生物合成关键代谢调控节点。结果表明WG-608中流向ε-PL合成的通量与M-Z18相比提高了27.8%,流向戊糖磷酸途径(PP途径)、回补途径、三羧酸循环途径(TCA途径)和L-赖氨酸合成途径的流量分别提高了11.1%、29.3%、5.5%和16.7%。本研究以代谢流的结果为基础确定了5个L-赖氨酸合成途径关键基因pyc(丙酮酸羧化酶基因)、ppc(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)、zwf(6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因)、dap A(二氢吡啶二羧酸合成酶基因)、lys A(二氨基庚二酸脱羧酶基因)和ε-PL合成酶基因(pls)。(2)分别对ppc、zwf、dap A、lysA、pyc和pls进行过表达,确定了ppc、pyc和pls可以促进ε-PL的合成,同时发现pls的过表达结合L-赖氨酸的外源流加可以显著提高ε-PL产量。在补料分批发酵方式下,过表达菌株OE-ppc、OE-pyc和OE-pls的ε-PL产量较出发菌株S.albulus WG-608分别提高2.8%、9.9%和16.3%,单位菌体合成能力分别提高12.7%、21.8%和56.4%,葡萄糖转化率分别提升了12.3%、10.2%和24.1%。在pls的过表达结合L-赖氨酸的连续流加策略下,经192 h的补料分批发酵,ε-PL产量达到61.30 g·L-1,与出发菌WG-608在同样策略下相比提高了35.4%。(3)对ppc、pyc和pls进行双串联或者三串联过表达,发现双串联和三串联过表达均能促进ε-PL的合成。经192 h的补料分批发酵,与出发菌株S.albulus WG-608相比,串联过表达菌株OE-ppc-pyc、OE-pls-pyc和OE-ppc-pyc-pls的ε-PL产量分别提高了14.1%、12.1%和11.3%,单位菌体合成能力分别提高了39.4%、25.2%和26.1%。可见多基因串联过表达可以实现ε-PL产量和单位菌体合成能力的提升,然而,多基因串联过表达菌株表现出菌体量下降,葡萄糖消耗速率增加的现象,这可能是由于长基因片段的插入给菌体的生长带来了较大负荷,以致于菌株需消耗更多碳源来维持自身对于能量等物质的需求和菌株的正常生长。将高产工程菌OE-ppc-pyc-pls与出发菌WG-608的代谢流进行对比,结果表明过表达确实达到了改变菌株代谢流效果。
其他文献
在蛋白组学分析中,如何实现巯基肽的高效、特异富集一直是一个挑战。针对该问题,首先以磁性纳米颗粒为基础,通过磁纳米颗粒上裸露的氨基与5MP基团进行反应,得到了具有p H响应性的捕获巯基肽的富集材料磁性纳米颗粒@5MP,然后以GSH作为验证富集的目标,进行了关于GSH的捕获与释放的探究。接着以羧甲基壳聚糖@5MP衍生物(O-CMC-PBS-5MP)富集材料为实验对象,探索了模拟p H响应条件下壳聚糖分
乳杆菌作为发酵食品常用的微生物,具有维持肠道菌群平衡、抑制病原微生物、促进营养物质吸收等独特的益生特性。目前对于菌株发酵性能的优化常采用基因改造、自然选育、诱变育种等方法。然而以上方法在安全性、时间周期上均存在不足,因此探寻快速有效提高菌株发酵特性的方法对食品工业具有重要意义。群体感应(quorum sensing)是细菌交流的信息系统,可以发挥调整自身发酵行为的作用,在前期的研究中也发现AI-2
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种能够产生多种活性物质、改善和治疗多种胃肠道疾病并增强宿主免疫力的细菌。研究表明,蜡样芽孢杆菌能平衡肠道菌群,但目前关于其调控肠道菌群机制的研究较少。对芽孢杆菌类的益生菌而言,活菌数与芽孢率对其益生功能的发挥具有较大影响。目前关于提高蜡样芽孢杆菌产量的报道也相对较少,且产量较低,因此有必要对蜡样芽孢杆菌的发酵工艺进行优化,以提高其产量与芽孢率。并进
氨基糖苷类抗生素(AGs)是通过抑制蛋白质合成,对多种致病菌有抗生素后效应的一类抗感染药物。西索米星是一种典型的氨基糖苷类抗生素,主要由伊尼奥小单胞菌发酵生产。它的化学结构仅比庆大霉素多一双键,但其体内抗菌活性强于庆大霉素。以西索米星为母核合成的第三代AGs,奈替米星和plazomicin,具有比母核更低的耳肾毒性,使得AGs在临床上的应用更具有前景。而国内西索米星的工业生产效价仅为1000U·m
ε-聚赖氨酸(epsilon-Poly-L-lysine,ε-PL)是一种阳离子型均聚氨基酸,由25~35个单体L-赖氨酸脱水缩合而成的。由于其广谱的抑菌性,良好的生物相容性和对人体与环境无公害等特性,ε-PL已被广泛应用于食品防腐、药物载体和生物材料领域。ε-PL主要由Streptomyces alublus在酸性p H下经好氧发酵获得。由于S.alublus生产效能较低且难以改造,导致ε-PL
蛋白质谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.44,protein glutaminase,PG)是近年来广泛关注的脱酰胺酶,属于酰胺基水解酶类。PG可以水解大分子蛋白质和一些小肽侧链的谷氨酰胺并生成蛋白质L-谷氨酸和氨,从而改善蛋白质的各项功能性质,降低植物蛋白酶的致敏性,在食品、生物医药以及化妆品等行业具有应用。PG最初报道来源于解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum
红曲色素是红曲霉代谢生成的天然色素,具有抗癌、抗氧化和抗肥胖等功能特性。黄酒酿造过程会产生大量废弃物,目前其综合利用水平很低,低值利用普遍,黄酒废弃物的随意排放,造成了资源浪费和严重影响生态环境安全的问题。本研究旨在探讨利用黄酒废弃物生产红曲色素的工艺,以实现对黄酒废弃物的高值化利用。本研究以红曲霉ZK-2为出发菌株,在摇瓶液态发酵条件下,探讨了黄酒糟和米浆水的料液比以及碎米添加量对红曲色素合成的
枸杞(Lycium barbarum L)属于茄科,在我国新疆、宁夏、甘肃和青海等地均有种植,其富含多种氨基酸、有机酸、粗纤维、粗蛋白等营养成分以及枸杞多糖等多种功能成分。枸杞酒的酿造可解决枸杞深加工问题,促进枸杞产业的发展。目前发酵枸杞酒所用酿酒酵母依赖于葡萄酒酵母或通用型果酒酵母,缺少专用的酿酒酵母导致枸杞酒香气不足以及典型性不突出等问题,限制了枸杞发酵酒行业的发展。因此,选育枸杞酒专用酿造菌
我国传统发酵食醋是在开放环境下以各类谷物为原料自然酿造而成,发酵过程中涉及的微生物种类多样、结构复杂。前期采用高通量测序方法已经确定了镇江香醋醋醅中以乳酸菌和醋酸菌为优势物种的细菌群落结构特征,但是对于发酵过程中细菌群落的结构和功能演替的监测尚缺少快速、无损、准确的方法。本论文采用单细胞拉曼光谱分析技术分析了镇江香醋酿醋微生物群落结构的发酵演替过程,并通过构建数学分析模型快速预测了醋酸发酵进程。首
浓香型大曲是浓香型白酒酿造的专用发酵剂,为酿造过程提供了糖化力与液化力,同时对浓香型白酒中特征风味的形成至关重要。因此,解析浓香型大曲的特征微生物与风味物质对浓香型白酒品质和产量的提升具有积极影响。目前对于浓香型白酒的研究主要集中于微生物群落结构解析、酿造过程微生物群落演替规律和产香功能微生物分析,缺少对浓香型大曲特征功能微生物和不同等级浓香型大曲发酵性能差异的探索。本研究利用宏基因组学和代谢组学