研究背景和目的：近年来,随着社会生活节奏的加快和人们作息、饮食习惯的改变,我国胃食管反流病(Gastroesophageal reflux diseases, GERD)发病率日益增高。GERD严重影响人们的生活质量,耗费大量卫生资源,对其发病机制的探索一直是本领域的研究热点。GERD的发病机制复杂,可能与防御因素和侵袭因素的不平衡有关。根据内镜结果可分为反流性食管炎(Reflux esophagitis,简称RE)和非糜烂性反流病(Non-erosive reflux disease,简称NERD)两种类型。目前GERD的治疗仍以质子泵抑制剂为主,但即使是足剂量足疗程,仍有40%的患者治疗失败,而且有效的病例多需要长期服药。有效治疗方法的缺失推动着研究者对其发病机制的深入探索及新治疗手段的开发。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,简称MAPKs)作为一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在细胞内的参与了细胞分化、炎症反应、细胞周期、细胞凋亡、器官发育和内脏高敏感等多方面的作用。p38 MAPK通路作为MAPK通路之一,Toll样受体、TNF-α、IL-1、热休克、脂多糖及缺氧等细胞刺激等因素可活化p38 MAPK,而p38 MAPK活化可上调TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等,从而诱发炎症反应。本课题的研究目的是探讨p38 MAPK通路在GRED发病过程中作用和地位。实验方法：第一部分：原代培养人食管上皮细胞,给予酸刺激(pH5.0)15分钟,观察p38 MAPK通路的变化；人食管上皮细胞给予p38 MAPK抑制剂SB203580进行预处理治疗,然后给予酸刺激(48小时内进行7次,每次持续15分钟),从炎症反应、诱导性一氧化氮合酶／一氧化氮通路、上皮紧密连接功能蛋白三个角度探讨p38 MAPK在酸刺激诱导的食管上皮细胞损伤过程中的作用。第二部分：原代培养人食管上皮细胞,给予胰蛋白酶刺激,观察p38 MAPK通路的变化；人食管上皮细胞给予p38 MAPK抑制剂SB203580进行预处理治疗,然后给予胰蛋白酶刺激(48小时内进行3次,每次持续4小时),从炎症反应、诱导性一氧化氮合酶／一氧化氮通路、上皮紧密连接功能蛋白三个角度探讨p38 MAPK在胰蛋白酶刺激诱导的食管上皮细胞损伤过程中的作用。第三部分：胃底结扎加幽门限制法诱导形成反流性食管炎(RE)模型,2周后,观察大鼠食管上皮中p38 MAPK通路的变化；给予p38 MAPK抑制剂SB203580进行治疗,2周后,检测胃内容物的酸碱度；大体观察和伊红苏木素染色观察食管的病变程度；考察食管上皮的屏障功能,检测食管组织中紧密连接功能蛋白的表达；检测食管组织中基质金属蛋白酶表达；CD68免疫染色考察食管上皮组织中炎性细胞的侵润程度,考察组织和血清中炎症因子的表达水平；考察食管组织中iNOS蛋白表达水平和NO产物含量。通过这些检测最终考察p38MAPK在胃底结扎加幽门限制法诱导形成反流性食管炎中的作用和地位。实验结果：第一部分：1)酸刺激15mmin后,食道上皮细胞中p38 MAPK的磷酸化程度随着酸pH值的下降而增加。结果提示酸刺激可以激动食道上皮细胞的p38 MAPK信号通路。2)酸刺激后,食道上皮细胞中IL-8, COX2, TNFa的mRNA水平明显增加；给予p38MAPK抑制剂SB203580进行预处理治疗干预,发现可以明显降低食道上皮细胞中IL-8, COX2, TNFa的mRNA水平。3)酸刺激后,食道上皮细胞中iNOS蛋白表达增加,NO水平增加；给予p38 MAPK抑制剂SB203580进行预处理治疗干预,发现可以明显降低食道上皮细胞中iNOS蛋白表达和NO水平。4)酸刺激后,食道上皮细胞中claudin-1、occludin、ZO-1的mRNA水平明显降低。给予p38 MAPK抑制剂SB203580预处理治疗,claudin-1、occludin、ZO-1的mRNA水平明显增加。第二部分：1)胰蛋白酶刺激4小时后,食道上皮细胞中p38 MAPK的磷酸化程度随着胰蛋白酶剂量的增加而增加。结果提示胰蛋白酶刺激激动了食道上皮细胞的p38 MAPK信号通路。2)胰蛋白酶刺激后,食道上皮细胞中IL-8,COX2,TNFα的mRNA水平明显增加；给予p38 MAPK抑制剂SB203580进行预处理治疗干预,发现可以明显降低食道上皮细胞中IL-8,COX2,TNFα的mRNA水平。胰蛋白酶刺激后,食道上皮细胞中iNOS蛋白表达增加,NO水平增加；给予p38 MAPK抑制剂SB203580进行预处理治疗干预,发现可以明显降低食道上皮细胞中iNOS蛋白表达和NO水平。3)胰蛋白酶刺激后,食道上皮细胞中claudin-1和ZO-1的mRNA水平明显增加,而occludin的mRNA水平没有明显变化；给予p38 MAPK抑制剂SB203580进行预处理治疗干预,发现可以明显增加食道上皮细胞中claudin-1和ZO-1的mRNA水平。第三部分：1)胃底结扎加幽门限制法诱导形成反流性食管炎(RE)模型,2周后,免疫组化和Western blotting分析发现,RE大鼠食管上皮组织中p38MAPK磷酸化水平明显增加,给予其抑制剂SB203580治疗,可以降低RE大鼠食管上皮组织中p38MAPK磷酸化水平。2)胃底结扎加幽门限制法诱导形成反流性食管炎(RE)模型,2周后,RE大鼠胃内容物的pH明显降低,而p38MAPK抑制剂SB203580治疗对之没有明显影响。术后2周后,RE实验组大鼠食管组织出现明显的出血和腐蚀病变,HE染色可见鳞状上皮基底细胞层增厚,乳头向上皮腔面延长,炎性细胞浸润,鳞状上皮气球样变；给予p38MAPK抑制剂SB203580治疗可以明显减轻食管组织的病变。3)RE模型2周后,RE大鼠食管上皮组织中claudin-1蛋白表达明显降低;上皮跨膜电阻抗(transepithelial electrical resistance, TER)明显降低,提示RE大鼠食管上皮的屏障功能明显下降。另外,RT-PCR结果显示RE大鼠食管组织中occludin和ZO-1的mRNA水平明显降低。给予p38MAPK抑制剂SB203580治疗后,RE大鼠食管上皮中claudin-1蛋白表达增加,跨膜电阻抗增加,occludin和ZO-1的mRNA水平明显。4)RE模型2周后,免疫组化结果显示RE大鼠食管上皮组织中基质金属蛋白酶3和9(matrix metalloproteinase, MMP)的蛋白表达水平明显增加；给予p38MAPK抑制剂SB203580治疗后,RE大鼠食管上皮中MMP3和MMP9蛋白表达明显降低。5)RE模型2周后,免疫组化结果显示RE大鼠食管上皮组织中CD68表达明显增加,提示上皮组织中炎性细胞侵润增加；RT-PCR结果显示RE大鼠食管组织中TNFα、 IL-6、IL-1β的mRNA水平明显增加,而ELISA结果显示RE大鼠血清中TNFα、 IL-6、IL-1β的蛋白水平明显增加。给予p38MAPK抑制剂SB203580治疗后,RE大鼠食管上皮中炎性细胞侵润减少(CD68表达降低),组织中TNFα、IL-6、IL-1β的mRNA水平明显降低,血清中TNFα、IL-6、IL-1β的蛋白水平明显降低。6)RE模型2周后,RE大鼠食管组织中诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)蛋白表达水平明显增加,组织中一氧化氮(nitric oxide, NO)产物水平明显增加,3-硝基络氨酸水平明显增加。给予p38MAPK抑制剂SB203580治疗后,RE大鼠食管iNOS蛋白表达降低,NO生成减少,3-硝基络氨酸水平降低。结论：在胃食管反流病中,胰蛋白酶和酸是通过激活p38 MAPK通路,诱发炎症,激动iNOS/NO,从而造成食道黏膜上皮细胞的炎性损伤。本研究从p38 MAPK通路阐述了胃食管反流病中食道黏膜损伤的潜在机制,为治疗反流性食道炎提供了一个崭新的靶点。