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肺癌是世界上致死率最高的恶性肿瘤,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌病例85%以上,是最常见的肺癌类型,研究NSCLC发生发展的机理一直是本领域的重点和难点。随着分子生物学研究手段的进步,人们已经意识到NSCLC不再是一种疾病,而是一类由特定基因驱动的异质性疾病,过去一尘不变的治疗模式已经不能适应个体化治疗的需求,以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)和ROS1激酶为代表的靶向治疗引领NSCLC精准医疗时代的到来,吉非替尼、厄洛替尼和克唑替尼等一系列酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)显著改善了NSCLC患者预后,极大的提高了患者生活质量,是过去十年肿瘤临床治疗和基础研究的重大突破。不幸的是几乎所有患者在接受TKIs治疗一段时间后耐药复发,严重影响了TKIs的长期疗效和临床应用,因此阐明TKIs耐药的分子机制、制定克服耐药的治疗策略、尽最大可能推迟耐药现象出现是临床医生和科学家共同面临的难题和挑战。TKIs耐药原因尚未完全解析,以EGFR TKIs获得性耐药为例,仍有约20%患者耐药机制不清,这部分患者也没有切实有效的耐药后治疗方案。多环芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,Ah R)是一个受配体活化的胞内受体,在过去的近40年里人们一直认为Ah R信号通路活化后转录激活下游代谢酶,其全部功能由转录因子活性介导;近些年研究发现Ah R还有一些生物学功能不依赖其转录活性,且Ah R调控细胞增殖、分化、凋亡、周期转化等新功能与代谢酶表达无关。Ah R在多种实体瘤组织和细胞系中过度表达,回顾性研究提示Ah R表达水平与肿瘤恶性程度正相关。课题组前期研究发现Ah R蛋白在TKIs耐药的患者标本中表达亦增加,但其意义并不清楚。本文揭示了Ah R蛋白负向调控NSCLC TKIs敏感性的作用,提出活化的Ah R作为衔接蛋白(adaptor protein)招募Src和Jak2两种激酶,形成的Jak2-Ah R-Src复合物可以绕过EGFR旁路活化下游PI3K/Akt和MEK/Erk信号通路导致TKIs耐药;在高表达内源性Ah R蛋白的耐药细胞用药物或sh RNA抑制Ah R可以逆转TKIs耐药性,而在敏感细胞过表达Ah R则导致TKIs耐药性;此外,Ah R与Src和Jak2蛋白相互作用不依赖其转录因子活性,活化的Ah R瞬时转位到近膜侧,携带胞浆内Src蛋白与Jak2结合,促使Jak2磷酸化Src,Jak2 TKIs和Src TKIs可以阻断Ah R蛋白介导的激酶旁路。本研究发现Ah R蛋白招募激酶的新功能,阐明了TKIs耐药患者Ah R表达增加的意义及其导致耐药的分子机制,为克服EGFR TKIs耐药提供新的思路。方法:(1)TCGA数据库和组织芯片分析Ah R在m RNA和蛋白水平与NSCLC恶性程度、淋巴结侵犯和患者预后的相关性。(2)构建野生型Ah R(Ah R WT)和组成型活化Ah R(Ah R CA)表达载体和sh RNA,包装慢病毒感染细胞,MTT、平板克隆、Western blot、IHC、TUNEL染色等实验研究上调和下调Ah R对EGFR TKIs敏感性的影响。(3)构建入核信号缺失的Ah RΔNLS突变体,sh RNA下调ARNT、cyp1a1和cyp1b1表达,检测Ah R转录活性对EGFR TKIs敏感性的影响。(4)慢病毒感染细胞过表达Src或sh RNA下调Src,使用Src TKIs抑制其激酶活性,MTT、Western blot、IHC等实验研究Src在Ah R信号通路活化导致EGFR TKIs耐药中的作用。(5)蛋白激酶芯片筛选引起Src磷酸化的激酶,HEK293细胞转染Jak2、Src和Ah R质粒,IP和Western blot实验研究Ah R和Jak2/Src激酶的相互作用。结果:(1)Ah R在m RNA水平与NSCLC级别和预后无明显相关性,相反,Ah R在蛋白水平表达越高,肿瘤侵袭性越强,患者预后越差。Western blot结果显示TKIs耐药细胞Ah R蛋白表达亦增加。(2)Ah R抑制剂α-NF或sh RNA下调Ah R,细胞学水平表达增敏EGFR TKIs,阻断下游PI3K/Akt和MEK/Erk信号通路,在裸鼠体内明显抑制瘤体体积,诱导细胞凋亡。(3)慢病毒过表达Ah R WT或配体活化Ah R信号通路导致敏感细胞EGFR TKIs耐药,Western blot显示细胞Akt和Erk磷酸化水平增加且不能被EGFR TKIs抑制,然而过表达Ah R CA则不能诱导耐药,不增加Akt和Erk磷酸化水平。(4)突变Ah R入核信号NLS,sh RNA下调ARNT,cyp1a1和cyp1b1,去除Ah R转录因子活性并不影响Ah R上述效应,说明Ah R引起耐药的作用与其靶基因转录无关。(5)生物信息学预测和体内外功能学实验显示Src激酶活化是Ah R导致耐药的关键事件,Ah R通过其SH2结合模体招募Src并促进Y416位点磷酸化,旁路活化下游PI3K/Akt和MEK/Erk信号通路。Src TKIs或Src sh RNA联合EGFR TKIs可以阻断持续性活化的PI3K/Akt和MEK/Erk信号通路,体外抑制细胞增殖,体内减少Ki67阳性细胞比例,克服EGFR TKIs耐药。(6)蛋白激酶芯片结果强烈提示Jak2磷酸化下游激酶的作用,IP实验显示活化Ah R信号通路促进Ah R蛋白瞬时转位到细胞近膜侧,招募Jak2和Src两个激酶,使下游PI3K/Akt和MEK/Erk通路活化,Jak2 TKIs和Jak2 sh RNA抑制Src磷酸化,克服Ah R活化导致的EGFR TKIs耐药。结论:总结整个课题,我们发现一个新的EGFR TKIs耐药机制:活化的Ah R促进Src磷酸化,旁路激活下游PI3K/Akt和MEK/Erk信号通路。Ah R本身不是激酶,但可以通过招募其它激酶提供旁路信号,导致敏感细胞TKIs耐受。值得注意的是Ah R与Jak2/Src蛋白相互作用不依赖其经典的转录因子活性,Ah R作为adaptor介导Jak2和Src相互作用,形成的Jak2-Ah R-Src复合物绕过EGFR磷酸化Akt和Erk,故Jak2、Ah R和Src均可作为克服TKIs耐药的治疗靶点。