论文部分内容阅读
目的课题组前期研究已发现人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchy stem cell,huc MSC)及其分泌的外泌体(huc MSC-exosome)能缓解由顺铂诱导的急慢性肾损伤,micro RNA(mi RNA)在其中发挥重要作用。在此基础上,本课题建立了大鼠单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)肾间质纤维化模型和转化生长因子β1(TGF-β1)细胞诱导模型,通过体内外实验评价huc MSC-exosome缓解肾间质纤维化中的作用,并初步探讨其中的作用机制。方法体内实验分3组,假手术组:SD大鼠经左侧腹部切口打开腹腔寻到输尿管后缝合;UUO组:SD大鼠开腹进行单侧输尿管结扎;huc MSC-exosome干预组:SD大鼠单侧输尿管结扎24h后,经尾静脉注射huc MSC-exosome。小动物活体成像观察huc MSC-exosome在大鼠模型体内的分布。术后不同时间点(12h,24h,48h,72h,7d,14d)采集大鼠血清,检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平;单侧输尿管结扎14d后处死大鼠,获取肾组织,HE染色观察不同组别的肾脏组织结构,Masson染色分析胶原沉积情况;免疫组织化学、免疫荧光、Western blot检测肾组织中上皮间质转化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)相关分子,上皮钙黏着蛋白(E-cadherin,E-cad)、神经钙黏着蛋白(N-cadherin,N-cad)、赖氨酸氧化酶相关蛋白2(LOXL2)及纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1、α1-I型胶原(COL1A1)的表达水平。体外实验:大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)种植于6孔板上,细胞不做任何处理的为对照组。诱导组采用40ng剂量的TGF-β1诱导NRK-52E细胞24h使细胞发生EMT改变,干预组在TGF-β1诱导后加入huc MSC-exosome共培养48h。倒置显微镜观察各组别的细胞形态和细胞密度。Western blot检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、LOXL2及α-SMA、TGF-β1、COL1A1的表达,q RT-PCR检测各组NRK-52E细胞mi RNA(mi R-199a、mi R-146b)的表达。结果小动物活体成像结果显示经尾静脉注射的荧光标记huc MSCexosome大部分到达损伤左肾,右肾、脾脏、肺中略有存在,假手术组各脏器均没有荧光表达,显示huc MSC-exosome具有向损伤部位趋化的能力;huc MSC-exosome干预组中血清肌酐尿素氮较UUO组显著下降,提示肾脏功能有所恢复;HE染色结果表明huc MSC-exosome干预组较UUO组,肾小管扩张减缓,炎性细胞浸润减少,肾小管结构完整;Masson染色结果显示,huc MSC-exosome干预组肾间质中胶原沉积减少;与UUO组相比,huc MSC-exosome干预组E-cadherin表达增加,N-cadherin减少,提示间质上皮转化,α-SMA、TGF-β1、COL1A1等纤维化相关蛋白表达下降,表明huc MSC-exosome干预后肾间质纤维化改善。免疫荧光、免疫组化和Western blot检测EMT进程中关键蛋白LOXL2,发现UUO组LOXL2表达上调,而huc MSC-exosome干预后LOXL2表达下降。TGF-β1诱导NRK-52E细胞形态出现显著变化,由原来的光滑卵圆形变为不规则长梭形,细胞密度明显下降,E-cadherin表达下降,N-cadherin增加。Huc MSC-exosome干预后,Western blot检测显示E-cadherin表达增加,N-cadherin、α-SMA、COL1A1、TGF-β1下调,EMT进程得到缓解。q RT-PCR检测三组细胞mi R-199a表达发现,TGF-β1诱导后mi R-199a表达低于对照组,而huc MSC-exosome干预后mi R-199a较诱导组含量明显增加,分析后具有统计学意义。制与LOXL2蛋白和huc MSC-exosome中包裹的mi RNAs有关。结论huc MSC-exosome在体内外均可逆转纤维化并缓解EMT,其作用机制与LOXL2蛋白和hucMSC-exosome中包裹的mi RNAs有关。