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仔猪早期断奶会产生机体免疫抑制、生长性能下降和肝脏代谢紊乱等不利影响。肝脏是机体响应应激和供应能量的重要代谢性器官,其代谢紊乱直接影响机体的生长以及代谢情况。断奶后,一方面,机体无氧糖酵解加快,循环系统中的乳酸经Cori循环进入肝脏待清除,导致肝脏中乳酸的含量升高;另一方面,乳酸在肝脏堆积会造成肝脏损伤,影响仔猪能量代谢,进一步加重由断奶应激造成的生长缓慢现象。因此,控制肝脏糖代谢紊乱和乳酸沉积,加快肝脏乳酸清除,可能是缓解仔猪断奶应激的关键措施之一。肝脏营养物质代谢过程会受到表观遗传修饰的精细调控,其中蛋白乙酰化修饰已经被证明存在于几乎所有的肝脏糖脂代谢过程中。组蛋白乙酰转移酶P300/CBP结合因子（P300/CBP associated factor,PCAF）被证明是诱导肝脏糖脂代谢紊乱的关键蛋白因子,它参与修饰并调控了营养物质代谢途径的众多关键酶,其中包括糖酵解途径关键酶和糖异生途径的关键转录因子。近年来的研究发现,炎症和应激条件下,人和啮齿类动物肝脏中乳酸会发生堆积,并伴随着PCAF的高度异常表达。因此我们提出科学问题,断奶应激下PCAF是否是调控仔猪肝脏乳酸代谢的关键靶点,其调控机制又是什么,这些重要的问题值得深入研究。本研究一方面以断奶仔猪为研究对象,探讨断奶仔猪肝脏乳酸代谢的乙酰化规律,深入挖掘PCAF修饰的乳酸代谢关键酶;另一方面,通过腺相关病毒小鼠实验和断奶仔猪群体饲喂山竹醇实验,揭示PCAF对肝脏乳酸代谢的调控机制及营养干预措施。第一部分断奶仔猪肝脏糖脂代谢的乙酰化规律研究本研究选择了3窝21日龄三元（杜×长×大）健康仔猪,在各窝中选取2头仔猪实施断奶（断奶组）,共计6头;其余仔猪中选取6头由母猪哺乳（哺乳组）。实验周期为7d,并在断奶后的第0d到第7d,每天对各仔猪进行称重测量、采血等,于28日龄屠宰仔猪取其肝脏样品进行实验室生化指标等检测。主要结果如下:1.生长性能及血液生化指标显示:与哺乳仔猪相比,断奶组仔猪的平均日采食量（Average daily feed intake,ADFI）和平均日增重（Average daily gain,ADG）均显著降低（P<0.05）,而料重比（Feed/Gain,F/G）显著升高（P<0.05）;血液尿氮水平、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）含量、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量、游离脂肪酸、乳酸及丙酮酸的含量均显著升高（P<0.05）,总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,T-AOC）,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）活性以及血液葡萄糖含量显著降低（P<0.05）。2.肝脏组织学和炎症反应指标显示:断奶仔猪组的肝脏组织结构较哺乳仔猪组受到较大损伤,肝脏和血液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量显著上升（P<0.05）,肝脏中炎症因子的m RNA表达量均显著上升（P<0.05）。3.肝脏糖脂代谢相关指标显示:与哺乳仔猪相比,断奶仔猪肝脏中乙酰辅酶A和乳酸的含量显著上升（P<0.05）,总胆固醇的含量显著下降（P<0.05）,长链酰基辅酶A脱氢酶（Long chain acyl-Co A dehydrogenase,LCAD）、羟酰基辅酶A脱氢酶（Hydroxyacyl-Co A Dehydrogenase,HADH）、肉毒碱棕榈酰转移酶（L-carnitine palmitoyltransferase-I,L-CPT-1）、葡萄糖激酶（Glucokinase,GK）和丙酮酸激酶（Pyruvate kinase,PK）蛋白表达量显著升高（P<0.05）,GK和L-CPT-1的酶活性显著上升（P<0.05）,乳酸脱氢酶B（Lactate dehydrogenase B chain,LDHB）的酶活性显著下降（P<0.05）。4.肝脏差异乙酰化蛋白组学结果显示:一共发现160个蛋白的251个位点的乙酰化水平发生显著性变化（断奶组/哺乳组）,其中58个蛋白乙酰化水平显著上调,102个蛋白乙酰化水平显著下调;KEGG结果显示大多数上调的乙酰化蛋白质均参与糖类代谢,大多数下调的参与脂肪酸代谢;乙酰化水平上升幅度最大的是LDHB,乙酰化位点的基序概率图结果说明LDHB的乙酰化极有可能在K82位点发生高度乙酰化。5.肝脏乙酰转移酶/去乙酰转移酶表达结果显示:断奶组肝脏中PCAF和P300表达量较哺乳仔猪显著上升（P<0.05）,沉默信息调节因子5（Silent information regulator 5,SIRT5）表达量显著下降（P<0.05）。以上结果表明,断奶仔猪肝脏会出现糖脂代谢紊乱的现象,乳酸会发生堆积。断奶仔猪肝脏LDHB-K82位点会发生高度乙酰化,并伴随着PCAF的异常表达。第二部分PCAF诱导肝细胞乳酸清除障碍的分子机制本研究分离培养了哺乳组和断奶组仔猪的肝细胞,结合小鼠肝细胞,利用Co-IP、定向乙酰化位点突变（K→Q模拟乙酰化;K→R模拟去乙酰化）、Western blot、RNA干涉及基因过表达等实验技术验证了PCAF和LDHB的修饰及调控关系,主要结果如下:1、13C标记乳酸的同位素示踪细胞实验表明,相比于哺乳组而言,断奶组猪肝细胞中丙酮酸13C标记的丰度下降了35-40%,而葡萄糖的13C标记的丰度下降了25-30%。6.乳酸脱氢酶两类同工酶双向活性分析结果显示,断奶仔猪肝细胞的LDHB活性（乳酸转化为丙酮酸）显著低于哺乳仔猪肝细胞（P<0.05）,而乳酸脱氢酶A（Lactate dehydrogenase A chain,LDHA）活性（丙酮酸转化为乳酸）无显著差异（P>0.05）。7.Co-IP实验结果显示,PCAF和SIRT5能够和LDHB发生互作,而P300与LDHB之间没有互作关系;共聚焦图片显示,PCAF、SIRT5和LDHB均主要存在于细胞质中,在细胞核中含量较低。8.发现PCAF在小鼠肝细胞中过表达会显著提高LDHB的乙酰化水平（P<0.05）,而过表达SIRT5会显著抑制LDHB的乙酰化水平;敲低PCAF会显著降低LDHB的乙酰化水平（P<0.05）,而敲低SIRT5会提高LDHB的乙酰化水平。定向位点突变实验结果显示,K82位点由K→R时会显著降低LDHB的乙酰化水平;过表达和敲低PCAF,会显著影响LDHB的乙酰化水平（P<0.05）,而SIRT5对其无显著调控作用。9.发现在小鼠肝细胞内干涉或敲除PCAF之后,LDHB的活性显著提升（乳酸到丙酮酸）（P<0.05）,肝细胞内NAD+/NADH的比率显著降低（P<0.05）;PCAF过表达显著降低了LDHB的活性（P<0.05）,显著增加了NAD+/NADH的比率（P<0.05）,PCAF抑制剂—蒽贝素的处理显著缓解了PCAF对LDHB活性的抑制（P<0.05）,蒽贝素的处理显著降低了NAD+/NADH比率（P<0.05）。将LDHB的K82位点体外定向突变后植入肝细胞表达,发现过表达和干涉PCAF对野生型LDHB的活性有显著影响（乳酸到丙酮酸）（P<0.05）,而对K82Q组和K82R组的LDHB酶活性无显著影响（P>0.05）。10.与过表达野生型LDHB的小鼠肝细胞相比,过表达K82Q突变体或野生型LDHB+Flag-PCAF的肝细胞乳酸向丙酮酸转化的比率显著降低了近50-60%（P<0.05）,而过表达K82R突变体或野生型LDHB+si PCAF的细胞中乳酸向丙酮酸转化的比率显著增加了近50%（P<0.05）。11.PCAF过表达显著降低了肝细胞线粒体DNA的含量及线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性（P<0.05）,PCAF敲低显著提高了DNA的含量及线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性（P<0.05）。以上结果表明,PCAF是调控LDHB-K82位点乙酰化的重要蛋白。PCAF乙酰化LDHB显著降低了肝脏乳酸向丙酮酸转化,阻碍了肝脏的乳酸清除,导致线粒体功能障碍。第三部分LDHB（K82）乙酰化对肝脏炎症反应及肝损伤的作用机制研究本研究选择了AAV8作为肝脏选择性的血清型,体外构建LDHB-K82定向位点突变体（LDHB-K82R和LDHB-K82Q;R和Q分别模拟K82位点的去乙酰化和乙酰化位点）,通过持续对断奶小鼠尾静脉注射的方法,建立了AAV8-LDHB（K82Q/R）断奶小鼠模型,实验组分为:对照组（断奶小鼠）,K82Q组（注射AAV8-LDHB-K82Q）和K82R组（注射AAV8-LDHB-K82R）。分析检测了肝脏及血液指标。主要结果如下:1、与对照组相比,K82R组小鼠血液中转氨酶ALT和AST的含量显著降低（P<0.05）,而K82Q组显著升高（P<0.05）。肝脏乳酸代谢方面,血液中乳酸含量和肝脏中乳酸含量呈现相同趋势（P<0.05）;K82R组小鼠肝脏丙酮酸含量则显著高于对照组和K82Q组（P<0.05）,肝脏中游离脂肪酸显著低于对照组和K82Q组（P<0.05）。2、肝脏抗氧化指标结果显示,与对照组相比,K82R组小鼠肝脏ROS水平和MDA含量显著降低,SOD活性显著升高（P<0.05）,K82Q组小鼠则相反（P<0.05）。3、肝脏组织学和炎症反应指标显示:对照组小鼠肝脏发生明显病理改变,K82R组肝脏损伤得到缓解,而K82Q组小鼠肝脏损伤进一步加重;与对照组相比,K82R组小鼠血液中TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-10含量及肝脏中这些炎性因子的表达显著低于对照组（P<0.05）,K82Q组则相反（P<0.05）。4、线粒体功能的结果显示:与对照组相比,K82R组小鼠肝脏线粒体DNA含量显著升高（P<0.05）,K82Q组显著降低（P<0.05）,肝脏线粒体复合物活性呈现相同趋势（P<0.05）。5、与对照组相比,K82R组小鼠显著降低了肝细胞核内的乳酸含量及H3K9乙酰化程度,显著升高了细胞核内组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）活性,而K82Q组相反（P<0.05）。K82R组小鼠肝细胞内促炎反应NF-κB信号通路上的磷酸化的IKKβ,IκBα和p65蛋白表达量最低,而K82Q组最高（P<0.05）。以上结果表明,LDHB（K82）乙酰化介导的乳酸堆积,是通过激活H3K9高度乙酰化,启动NF-κB炎症反应信号通路基因表达,从而造成了肝脏损伤及线粒体功能障碍。第四部分山竹醇缓解断奶仔猪肝脏乳酸堆积的作用机理研究本试验通过选取24头健康状况良好、胎次相近的21日龄断奶仔猪,随机分为4个组,对照组饲喂基础日粮,分别在基础日粮中添加200mg/kg（低浓度）、400mg/kg（中浓度）和600mg/kg（高浓度）山竹醇饲喂断奶仔猪,每组6个重复,每个重复1头仔猪,试验期28d。实验结束后测定断奶仔猪的生长性能、抗氧化能力、肝脏炎症反应及乳酸代谢相关指标,探究山竹醇是否能通过调控PCAF来调节断奶仔猪肝脏的乳酸堆积问题,进而缓解断奶应激。主要结果如下:1、生长性能结果显示,与对照组相比,日粮添加山竹醇显著提高断奶仔猪的ADFI和ADG（P<0.05）,中浓度山竹醇组显著降低F/G（P<0.05）。2、血液指标显示,与对照组相比,日粮饲喂低、中、高浓度山竹醇组的总蛋白和白蛋白有升高的趋势,但无显著差异（P>0.05）;血液尿氮水平显著降低（P<0.05）;血液中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶均显著升高（P<0.05）;丙二醛含量显著降低（P<0.05）,T-AOC,SOD和GSH-Px活性显著升高（P<0.05）;血液中乳酸的含量显著降低（P<0.05）,葡萄糖含量显著升高（P<0.05）。中、高浓度山竹醇组的丙二醛含量以及乳酸的含量显著低于低浓度山竹醇组（P<0.05）。3、肝脏炎症反应与乳酸代谢的结果表明,日粮添加山竹醇能够显著升高肝脏中Ig A、Ig G、Ig M的含量（P<0.05）,显著降低血液中TNF-α、IL-1β、IL-6以及肝脏乳酸的含量（P<0.05）,显著抑制了肝脏中TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA表达量（P<0.05）,显著缓解了肝脏损伤。4、线粒体功能的结果显示,日粮添加山竹醇显著降低了肝脏线粒体DNA含量和线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性（P<0.05）。5、PCAF、LDHB活性及乙酰化结果显示,日粮添加山竹醇能够显著降低PCAF活性（P<0.05）,显著降低LDHB乙酰化水平（P<0.05）,显著增加LDHB活性（P<0.05）,显著降低H3K9乙酰化水平。以上结果表明,日粮添加山竹醇能够提高断奶仔猪生长性能,抗氧化能力和机体免疫功能,缓解了断奶仔猪肝脏乳酸堆积和炎症反应及线粒体功能障碍。综上所述,本研究的主要结论如下:（1）断奶会导致仔猪肝脏乳酸发生堆积,LDHB-K82高度乙酰化以及PCAF的高度表达。（2）PCAF乙酰化LDHB-K82能够显著降低肝脏中乳酸向丙酮酸的转化,阻碍了肝脏的乳酸清除。（3）LDHB-K82乙酰化诱导的乳酸堆积通过诱发组蛋白H3K9的高度乙酰化,加重了肝脏的炎症反应,导致肝脏损伤。（4）日粮添加山竹醇能够提高断奶仔猪生长性能,抗氧化能力和机体免疫功能,缓解了断奶仔猪肝脏乳酸堆积和炎症反应及线粒体功能障碍。