本论文在研究大豆灰斑病菌产毒条件的基础上，分离出大豆灰斑病菌的粗毒素，用生物测定的方法明确了所提取的粗毒素的致病作用，并用粗毒素进行了抗性鉴定。然后又进一步对10个生理小种粗毒素组分进行了鉴定，分析了10个生理小种粗毒素的蛋白组分与其生理小种田间致病力之间的关系，为进一步明确灰斑病菌的毒素是致病因子提供了更确凿的依据。在以上的研究基础上，又进一步地研究了大豆灰斑病菌及其粗毒素以及化学因子等对大豆叶片内与抗病性密切相关的生化物质的诱导作用，旨在探索大豆灰斑病菌及其毒素的生化致病机制与诱导抗性机制。本研究的主要结论如下： 1 大豆灰斑病菌粗毒素的提取及致病活性的测定 大豆灰斑病菌的最佳产毒条件是利用Czapek培养基，以蔗糖作为碳源，糖含量为3％，将培养基的pH调到6.0，接种新鲜菌丝三块，在25～28℃黑暗条件下静止培养25～27天。用甲醇、乙醇、丙醇和硫酸铵等两种沉淀大分子物质的方法，均提取到使大豆叶片产生典型病斑和致萎毒性的化合物，且该粗提物确实能引起大豆感病品种产生典型的病斑症状，由此可以肯定从培养滤液中提取的粗提物符合毒素的概念，可将其称为大豆灰斑病菌所产生的粗毒素。同时灰斑病菌的粗毒素使感病品种叶片产生典型的灰斑病病斑，而抗病品种则表现出对粗毒素的明显抗性，从而可进一步说明灰斑病菌的次生代谢产物——粗毒素是大豆灰斑病的致病因子之一。其中以二倍体积的甲醇来沉淀大豆灰斑病菌毒素最为简单、快速且彻底。 其中离体叶片萎蔫法可以作为测定灰斑病菌粗毒素含量和致病活性的定量生测方法。另外叶片针刺法和幼苗法均体现出所提取粗毒素的致病性及其对抗感品种的毒性作用与田间接种结果的一致性。通过叶片萎蔫法验证了1～10号生理小种粗毒素的致病性与田间接种鉴定抗感品种的结果符合率高达91％。本研究还利用叶片针刺法，观察了大豆灰斑病菌粗毒素对不同作物产生的致病活性，初步的结果表明大豆灰斑病菌粗毒素属于非寄主选择性毒素。 2 大豆灰斑病菌粗毒素组分及特性的研究 灰斑病菌不同生理小种粗毒素中的蛋白质含量和多糖含量的差别，反应了各生理小种所产生毒素是不同的。粗毒素中蛋白质组分及其含量高低在灰斑病菌毒素的致病作用中起主要作用，多糖组分在灰斑病菌毒素的致病作用中也起到一定的致毒作用。粗毒素对热有一定的敏感性，不同生理小种的粗毒素经6NHCl处理后，因蛋白质组分变性失活和多糖组分的彻底水解而丧失全部的生物活性。SDS—PAGE的电泳图谱说明大豆灰斑病菌粗毒素蛋白质大多数都是糖蛋白。此外，10个生理小种田间致病力聚类结果与10个生理小种(除3、8号小种)中的8个生理小种的粗毒素的蛋白质聚类结果相符合，说明粗毒素确是引起大豆发生灰斑病的重要致病因子之一。 3 大豆灰斑病菌及其粗毒素对大豆叶片内几种生化物质的诱导作用 灰斑病菌粗毒素浓度较低时发挥激发子的作用，而浓度达到一定高度时则发挥毒性作用。不同的生理小种的粗毒素的诱导作用存在差异。东北农业大学博士学位论文 摘要 同一生理小种的粗毒素与灰斑病菌对大豆叶片内PAL活性、总多酚类含量、总黄酮含量以及几丁质酶活性等几种生化指标均表现出相似的诱导作用，由此可推断粗毒素是诱导大豆叶片内的PAL活性、总多酚含量、总黄酮含量以及几丁质酶活性产生变化的主要生物因子，只是二者在对抗性不同的大豆品种的诱导速度及强度上存在一定的差异。其一：粗毒素对抗病品种的PAL活性和总黄酮含量的诱导速度比灰斑病菌快，而粗毒素对感病品种的PAL活性、总多酚含量、总黄酮含量和几丁质酶活性的抑制作用则比灰斑病菌出现的早，由此可推断粗毒素是大豆感病品种发病的重要致病因子；其二：粗毒素对抗病品种叶片内PAL活性、总黄酮含量和几丁质酶活性的诱导作用比灰斑病菌强。其三：灰斑病菌及其粗毒素对抗病品种的PAL活性和几丁质酶活性的诱导作用强于对感病品种的诱导作用，可推断灰斑病菌及其粗毒素是使大豆品种产生抗性反应的生物激发子，或者说灰斑病菌及其粗毒素对抗病品种主要起激发子的作用而对感病品种则主要起抑制子的作用。4大豆产生抗住伤质的诱导因于 乙烯利、草酸和水杨酸这三种化学因子同灰斑病菌粗毒素一样，分别在各自适合的浓度下均对大豆叶片内的总多酚含量、总黄酮含量、PAL活性和几丁质酶活性等生化指标具有诱导作用。其中水杨酸作为外源化学因子在相同浓度诱导下与粗毒素对抗感品种的诱导作用是一致的。可见，无论是生物因子还是化学因子均能诱导大豆体内抗性物质的变化，而且具有相似的生化诱导抗性机制。