【摘 要】
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研究背景:食管癌是常见的恶性肿瘤,在我国,食管癌相关死亡率位居恶性肿瘤致死的第四位。降低原发性肿瘤的死亡率有效手段是在早期阶段进行检测并诊断,然而食管癌发病隐匿,目前尚缺乏有效的食管癌早期诊断手段。因此,研究食管癌的相关分子机制,探索食管癌早期筛查、诊断以及治疗的新策略、新技术迫在眉睫。既往研究发现,端粒结合蛋白在多种消化道肿瘤中呈异常表达,且其与端粒长度和及端粒酶的活性具有相关性。TPP1作为端
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研究背景:食管癌是常见的恶性肿瘤,在我国,食管癌相关死亡率位居恶性肿瘤致死的第四位。降低原发性肿瘤的死亡率有效手段是在早期阶段进行检测并诊断,然而食管癌发病隐匿,目前尚缺乏有效的食管癌早期诊断手段。因此,研究食管癌的相关分子机制,探索食管癌早期筛查、诊断以及治疗的新策略、新技术迫在眉睫。既往研究发现,端粒结合蛋白在多种消化道肿瘤中呈异常表达,且其与端粒长度和及端粒酶的活性具有相关性。TPP1作为端粒结合蛋白中的重要分子之一,在多种肿瘤中均有研究,包括神经胶质瘤、子宫颈癌、结肠癌以及B淋巴细胞白血病等,但是TPP1在食管癌的研究目前尚未见报道。因此,本研究拟探讨TPP1在食管癌中的具体作用及其分子作用机理,旨在更为深入地认识食管癌发生的机制以及探寻其诊治的新途径与新靶点。研究目的:1.明确端粒保护蛋白TPP1在食管癌组织中的表达并探讨其与临床病理间的相互关系;2.探讨TPP1在食管癌细胞中的作用及其分子机理。研究方法:1.收集川北医学院附属医院心胸外科2015年7月到2016年3月65例食管癌患者行手术治疗所取得的癌组织标本和癌旁组织,提取组织RNA和蛋白质,应用实时定量PCR和Western Blot检测端粒保护蛋白的表达;2.收集病人临床病理资料,包括肿瘤的大小、位置、分期、淋巴结转移以及肿瘤分化情况,和病人的肿瘤标志物CYFRA21-1（细胞角蛋白19片段）等,分析TPP1与淋巴结转移和肿瘤标志物的相关性。3.培养食管癌细胞Eca109、Kyse150、TE1和人食管上皮细胞HET-1A,提取敲低表达质粒shTPP1、sh P53以及对照质粒sh-NC,并分别转染食管癌细胞。应用免疫荧光显微镜观察shTPP1和sh-NC的转染效率,利用嘌呤霉素筛选sh P53和sh-NC转染成功的食管癌细胞,同时应用实时定量PCR和western blot检测转染质粒TPP1的P53的表达变化;4.应用细胞生长曲线、划痕实验和transwell小室实验,分别检测转染shTPP1和sh P53质粒后对食管癌细胞的生长增殖和迁移能力的影响。研究结果:1.PCR检测端粒保护蛋白在65对食管癌组织和癌旁组织的m RNA表达,TPP1、TRF2、POT1、TIN2在癌组织的m RNA水平均高于癌旁组织（P＜0.05）。TRF1和Rap1的m RNA表达水平无差异（P＞0.05）。2.Western blot检测TPP1在食管癌和癌旁组织的蛋白表达,其中46例患者食管癌组织TPP1蛋白表达高于对应的癌旁组织,19例患者其蛋白表达未见明显差异。3.与临床病理资料分析发现,TPP1与食管癌淋巴结转移呈相关;其中42例患者检测了外周血血清肿瘤标志物,TPP1高表达与食管肿瘤标志物CYFRA21-1血清浓度具有相关性。4.shTPP1和sh P53质粒转染食管癌细胞后,TPP1和P53的m RNA和蛋白水平表达均低于对照组。5.转染shTPP1和sh P53质粒后,食管癌细胞的增殖能力和迁移能力均较对照组降低。6.分别敲低Kyse150和TE1细胞中P53后,发现TPP1蛋白水平显著上升;同时,AKT-m TOR细胞信号转导通路相关分子p-AKT、p-m TOR、p-P70S6K、4EBP1均明显上调;细胞自噬标志物LC3、P62蛋白表达显著降低。结论:1.端粒保护蛋白TPP1在食管癌的表达水平高于与之对应的癌旁组织,且与食管癌淋巴结转移和外周血血清CYFRA21-1浓度呈正相关;2.食管癌细胞中P53可通过AKT-m TOR细胞信号转导通路调控TPP1的表达,诱导细胞发生自噬。
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