中国卤虫胚胎滞育解除过程中akt/pkb基因的作用及表达模式

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本文采用RACE技术以中国卤虫为实验材料对akt的cDNA全长序列进行了研究,利用原位杂交技术和实时荧光定量PCR技术分别对中国卤虫As-akt基因的表达部位以及As-akt和As-pdk1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1)在中国卤虫不同胚胎发育时期、盐度和温度胁迫中的表达量进行研究。中国卤虫(Artemia sinica)广泛分布于盐湖、盐田等高盐水体中,由于含有较高的不饱和脂肪酸和蛋白质等特点,是水产养殖中重要的开口饵料。中国卤虫的生殖方式存在卵胎生和卵生两种方式。当环境胁迫时,中国卤虫以卵生方式产生滞育胚胎(滞育卵),以对抗干燥、寒冷、冰冻等恶劣环境,以减少不良环境对胚胎的影响。此时,胚胎停止发育,新陈代谢减慢。因此,滞育在中国卤虫应对环境胁迫,保护胚胎存活的的过程中起着非常重要的作用。丝氨酸苏氨酸蛋白激酶Akt也被称做蛋白激酶B(PKB),是细胞内非常重要的一种信号分子。Akt在细胞生长,增殖,分化,运动,葡萄糖稳态,细胞存活以及细胞凋亡等多种胚胎发育过程中发挥着重要的作用。但对于akt基因在中国卤虫滞育解除过程中、胚胎发育过程中以及高盐、低温胁迫下的表达未见报道,有待进一步深入研究和分析。分子克隆和生物信息学的实验结果证明,中国卤虫的akt cDNA全长序列为1613bp,它包括1416bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)这段序列编码472个氨基酸序列。使用ClustalX和MEGA4.0软件对中国卤虫akt基因的氨基酸序列与其他物种该基因的氨基酸序列进行分子进化分析,使用多种在线软件对As-akt基因的氨基酸序列的信号肽、跨膜区域、亲疏水性以及磷酸化位点等进行分析。Akt分子量为54.41kD,理论等电点为7.97。原位杂交实验结果显示在0h-20h在胚胎中均匀分布,在40h,3d,5d主要分布在头部、胸部、腹部以及附属物质里。实时荧光定量PCR实验结果显示As-akt和As-pdk1在中国卤虫胚胎发育的各时期相对表达量不同,在原肠胚阶段、后无节幼体阶段和拟成虫阶段表达量较高。在高盐和低温胁迫下随着盐度的提高和温度的不断降低As-akt和As-pdk1的相对表达量明显升高。上述这些结果均显示As-akt在中国卤虫抵抗细胞凋亡和在胚胎滞育解除过程中发挥了极其重要的作用。因此,研究As-akt基因在中国卤虫中的表达模式对研究卤虫的胚胎滞育解除的分子机制具有重要的理论意义,对卤虫资源的进一步开发利用有一定的潜在应用价值。
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