飞龙掌血Toddalia asiatica Lam为芸香科(Rutaceae)飞龙掌血属(Toddalia)植物,在我国主要分布于秦岭以南各地。味辛、微苦,性温,具有祛风除湿、散瘀止血、消肿解毒的功效。飞龙掌血主要用来治疗跌打损伤、风湿骨痛、腰痛、痛经以及毒蛇咬伤等病症,效果显著,且民间用于治疗类风湿性关节炎(RA)的药用历史悠久。飞龙掌血的主要化学成分为香豆素和生物碱类,关于其发挥镇痛抗炎作用的活性成分及作用机制的报道均较少。本课题拟进一步研究飞龙掌血的镇痛抗炎活性部位和活性成分,并考察其镇痛抗炎作用的机制。一.飞龙掌血各部位的免疫调节作用及其镇痛抗炎活性的研究采用热回流提取方法得飞龙掌血总浸膏,依次萃取得生物碱浸膏和乙酸乙酯浸膏(将其进一步分为EⅠ、EⅡ、EⅢ三个部位)并作为研究对象,实验内容及结果如下：1.免疫调节作用的考察：采用MTT法研究生物碱浸膏和乙酸乙酯浸膏对ConA和LPS诱导小鼠T、B淋巴细胞增殖的作用,同时采用流式细胞术检测其对T淋巴细胞亚群的影响,结果表明它们均能通过改变T淋巴细胞(CD4+、CD8+)的数目或亚群来调节机体的免疫功能。2.体内镇痛抗炎活性研究：采用小鼠醋酸扭体、热板法和二甲苯致小鼠耳肿胀三个实验,结果显示生物碱浸膏、乙酸乙酯浸膏及其EI部位具有较好的镇痛及抗炎活性,能显著抑制小鼠的扭体反应和耳肿胀程度,降低痛阈值。同时采用纳洛酮拮抗实验和利血平影响实验初步考察其镇痛机制,结果表明生物碱部位的镇痛作用受到利血平的拮抗,而乙酸乙酯及其EI部位的镇痛作用部分被纳洛酮拮抗。3.抗RA活性研究：采用II型胶原建立CIA小鼠模型,检测各部位对CIA小鼠的体重、足肿胀程度、脾脏指数、关节病理变化及评分、血清中细胞因子水平的影响,结果表明生物碱浸膏和乙酸乙酯EI部位对CIA模型均具有显著的改善作用,能通过缓解脾脏肿大及调节细胞因子TNF-α、IL-17、IL-6和IL-10的水平而改善其足垫和踝关节的肿胀,抑制关节软骨和滑膜的过度增生等。二.飞龙掌血的体外抗炎活性及机制的研究以飞龙掌血浸膏及部分单体化合物(香豆索和生物碱)为研究对象,实验内容及结果如下：1.对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞增殖的影响：采用MTT法研究其对该模型是否具有细胞毒作用,结果表明飞龙掌血总膏、乙酸乙酯EI浸膏和生物碱浸膏以及茴芹内酯、toddaculin、异茴芹内酯、氧化白屈菜碱在高浓度时具有一定的细胞毒性,而omphalocarpin、二氢白屈菜红碱、茵芋碱、Y-花椒碱均无明显的细胞毒性。2.对NO水平的调节：采用Griess法检测它们对细胞培养上清液中NO水平的影响,结果显示除茴芹内酯、toddaculin、异茴芹内酯、氧化白屈菜碱以外,其余成分均具有一定的NO抑制作用。3.对TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS水平的影响：采用ELISA法检测细胞培养上清液中几种炎症介质水平的变化,结果表明飞龙掌血总膏、乙酸乙酯EI浸膏、生物碱浸膏以及omphalocarpin、茵芋碱均可显著下调这几种因子的水平。4.茵芋碱与omphalocarpin对COX-2、iNOS的表达以及NF-κB通路的影响：采用Western Blotting法,结果显示二者均能显著抑制COX-2和iNOS两种蛋白的表达及NF-κB的转录活性(抑制胞浆中IκB-α蛋白的磷酸化以及NF-κB p65蛋白易位至细胞核的水平),说明它们可能通过抑制NF-κB的转录活性下调各种炎性介质如NO、TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS的水平。5.对RA成纤维样滑膜细胞(FLS)的增殖及其释放MMP-13和IL-1β的影响：采用CCK-8法研究对RA FLS增殖的作用,并运用流式细胞术检测其对细胞周期的影响,ELISA法检测MMP-13和IL-1β的水平,结果表明飞龙掌血总膏、乙酸乙酯EI浸膏、生物碱浸膏以及茵芋碱、omphalocarpin均能使细胞大量停留于DNA合成前期,从而抑制TNF-α诱导RA FLS增殖的程度,同时明显下调RAFLS分泌MMP-13和IL-1β的水平。三.主要化学成分的镇痛抗炎活性的研究以茴芹内酯、异茴芹内酯、omphalocarpin和茵芋碱四个主要成分为研究对象,实验内容及结果如下：1.体内镇痛抗炎活性研究：采用小鼠醋酸扭体、热板法和二甲苯致小鼠耳肿胀三个实验,结果显示茵芋碱与omphalocarpin具有较好的活性,能显著抑制小鼠的扭体反应和耳肿胀程度,降低痛闽值。同时采用纳洛酮拈抗实验和利血平影响实验初步考察其镇痛机制,结果表明二者的镇痛作用受到利血平的拮抗,而不受纳洛酮的影响。2.抗RA活性研究：采用II型胶原建立CIA小鼠模型,检测单体成分对CIA小鼠的体重、足肿胀程度、脾脏指数、关节病理变化及评分、血清中细胞因子水平的影响,结果表明茵芋碱对CIA小鼠的关节症状具有明显的缓解作用,能通过减轻脾脏肿大及调节细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平而改善其足垫和踝关节的肿胀,抑制关节软骨和滑膜的过度增生等。本课题进一步明确了飞龙掌血的镇痛抗炎活性成分及其机制,并首次筛选了飞龙掌血中主要单体成分的镇痛抗炎活性及抗RA作用；首次采用T、B淋巴细胞的体外增殖模型研究了飞龙掌血的免疫调节作用；首次采用纳洛酮拮抗实验和利血平影响实验初步考察了各活性成分的镇痛作用机制；同时首次通过LPS诱导RAW264.7巨噬细胞增殖和TNF-α诱导大鼠RAFLS增殖的模型深入探究了飞龙掌血的抗炎作用机制。以上结果说明飞龙掌血可能是通过抑制与RA相关的各种细胞中NF-KB的转录水平,进而调节这些细胞对炎性介质的释放并抑制与炎症相关的酶的活性和表达,从而影响参与RA的免疫细胞如巨噬细胞的增殖与活化,以及RA中出现特征性病变的滑膜组织中滑膜细胞的增殖与活化,从多个方面改善RA的炎症免疫反应。总之,民族药飞龙掌血对RA具有很好的治疗作用。