论文部分内容阅读
目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统(central nervous system,CNS)白质脱髓鞘为主要病理特点的慢性炎性自身免疫性疾病。现公认小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)为研究MS的动物模型。目前关于MS的发病机制尚未完全明确,CD4+T淋巴细胞介导的对自身髓鞘抗原产生的免疫应答为其可能的发病机制。被激活的免疫细胞产生大量的炎性细胞因子进入血脑屏障(Blood brain barrier,BBB),破坏神经元和少突胶质细胞,这些炎性细胞因子包括IL-12、IL-6、IL-17、IL-21、IL-23等。近年研究发现激酶/信号转导及转录激活子(Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription,JAK/STAT)通路调节这些细胞因子的生物学活动,为调控免疫应答所必需。JAK/STAT通路的失调可以导致很多自身免疫性疾病,其中包括MS/EAE。在MS/EAE中,由于大量细胞因子的产生,相关负向调节因子的缺失,如细胞因子信号抑制物(suppressors of cytokine signaling proteins,SOCS),以及JAK/STAT基因编码产物的富集,如STAT3,JAK/STAT通路被异常激活。在MS实验模型中应用特定的JAK/STAT抑制剂,对缓解固有免疫及适应性免疫有较好的效果[1]。目前针对MS尚未发现有效的治疗药物,现在应用于MS的临床药物主要有IFN-β,醋酸格拉替雷和米托蒽醌。但由于药物毒副作用较大,应用受到限制。本实验用药鲁索利替尼为一种选择性JAK1/JAK2激酶抑制剂,目前用于人骨髓纤维化的治疗。其作用机制包括JAK1介导的促炎症细胞因子的下调,JAK2相关的促红细胞生成及免疫细胞活化功能调节,STAT3磷酸化抑制,炎症细胞因子水平及信号下调。鲁索利替尼对MS的作用尚未明确,本实验以鲁索利替尼作为干预药物,观察EAE小鼠及鲁索利替尼治疗小鼠发病严重程度及体内炎症因子水平变化。探索鲁索利替尼在EAE免疫学机制中发挥的作用。方法:将80只8至10周的雌性C57BL/6小鼠,体重约为18g-20g,随机分为control组,EAE组,鲁索利替尼大剂量组和鲁索利替尼小剂量组,每组20只。建立EAE模型。鲁索利替尼粉剂溶于1:1的乙醇:PBS溶剂。鲁索利替尼大剂量组于建立模型完成当天(记为第0天)起,每只隔天腹腔注射10ml/Kg鲁索利替尼大剂量溶剂(0.5mg/ml);鲁索利替尼小剂量组自第0天,每只隔天腹腔注射10ml/Kg鲁索利替尼小剂量溶剂(0.25mg/ml);control及EAE组自第0天,每只隔天腹腔注射1:1乙醇:0.01M PBS溶液10 ml/Kg。直至处死。每天早晨对其进行称重和神经功能评分。利用实时定量PCR技术检测小鼠脾中IL-6、IL-17、STAT3、TNF-α、Fox P3+的m RNA表达水平。用ELISA的方法检测小鼠血清中IL-6及TNF-α的蛋白表达水平。利用流式细胞学技术对各组CD4+CD25+Foxp3+调节型T细胞占CD4+T细胞的比例进行比较。结果:1免疫后第25天,鲁索利替尼组平均神经功能评分较EAE组显著降低(P<0.05)。鲁索利替尼大剂量组发病率较EAE组显著降低(P<0.05),鲁索利替尼小剂量组发病率较EAE组无明显差异(P>0.05)。EAE平均发病潜伏期为(15.22±1.72)d,鲁索利替尼大剂量组平均发病潜伏期为(18.17±1.85)d,鲁索利替尼小剂量组平均发病潜伏期为(17.75±1.49)d;2各组小鼠脾组织中TNF-α、IL-17、IL-6、STAT3、Fox P3+的m RNA水平:在免疫后第25天时,与control组相比,EAE组TNF-α、IL-17、IL-6、STAT3 m RNA水平均增高(P<0.01),Fox P3+m RNA水平较control组无明显差异(P>0.05)。鲁索利替尼大剂量组TNF-α、IL-17、IL-6、STAT3m RNA水平较EAE组低,有统计学差异(P<0.01),Fox P3+m RNA水平较EAE组升高,有统计学差异(P<0.01)。鲁索利替尼小剂量组TNF-α、IL-6、STAT3 m RNA水平较EAE组低,有统计学差异(P<0.01),Fox P3+m RNA水平较EAE组明显升高(P<0.01),IL-17m RNA水平较EAE组无明显统计学差异(P>0.05);3各组小鼠血清中IL-6和TNF-α蛋白表达水平:在免疫后第25天时,与control组相比,EAE组IL-6、TNF-α表达增高,有统计学差异(P<0.05)。与EAE组相比,鲁索利替尼大剂量组IL-6、TNF-α表达降低,有统计学差异(P<0.05)。鲁索利替尼小剂量组较EAE组TNF-α表达降低,有统计学差异(P<0.05);IL-6表达较EAE组无明显差异(P>0.05);4各组CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的比例:在免疫后第25天时,与control组相比,EAE组CD4+CD25+Foxp3+调节型T细胞占CD4+T细胞的比例降低,有统计学差异(P<0.05);鲁索利替尼组无显著差异(P>0.05)。与EAE组相比,鲁索利替尼组CD4+CD25+Foxp3+调节型T细胞占CD4+T细胞的比例升高,有统计学意义(P<0.05)。结论:1 EAE发病时炎性因子释放增加,JAK/STAT通路激活,调节性T细胞比例降低。2鲁索利替尼可以减轻EAE小鼠神经功能损害严重程度,降低发病率。3鲁索利替尼可以降低EAE脾及血清中促炎症细胞因子IL-6、IL-17、TNF-α的水平,且降低程度与用药剂量正相关。鲁索利替尼可以增加Fox P3+表达水平,具有免疫应答负调节及调节自身免疫耐受的作用。4鲁索利替尼可以提高CD4~+CD25~+Foxp3+调节型T细胞占CD4~+T细胞的比例,对EAE的发病及发展起到保护作用。5鲁索利替尼可以降低EAE脾中STAT3的表达,抑制JAK/STAT通路。