光学显微镜作为观察微观世界的重要手段,一直是现代生物医学研究中不可或缺的重要工具。从最初的对染色的植物细胞的二维低分辨的观察,演化到对器官或小动物进行单细胞分辨率的高特异性,高分辨率,多个维度的快速观察。光片荧光显微镜作为一种新型的三维成像技术,凭借其低光漂白、低光毒性和快速三维成像能力,广泛应用于现代生物医学研究。然而,目前的光片显微成像中存在以下几个问题:分辨率和视野相矛盾的问题,大样品厚组织的光吸收和散射。针对以上问题,本文做了以下研究:首先,本文在常规高斯光片显微镜的基础上,设计了一种亚体素光片显微镜。与常规光片的Z轴扫描不同,亚体素光片采用斜轴扫描的方式。利用斜轴扫描,通过设定扫描步长,可以产生具备亚体素位移的原始图像。然后利用亚体素超分辨方法,对原始图像进行分组,通过极大似然估计迭代计算高分辨三维图像。通过利用荧光微球来测量系统的点扩散函数,亚体素显微镜可以将横向和轴向分辨率分别提升3-4倍和2-3倍,从而实现大视场下的高分辨三维成像。然后利用该系统对三维培养的NHBE细胞、斑马鱼胚胎以及透明化鼠脑经行成像,展示其在生物医学上的应用。然后,进一步将亚体素和多视角融合相结合,开发了多角度亚体素光片显微镜。通过获取多个角度的具备超分辨能力的三维图像,对每个角度下的图像进行亚体素超分辨处理,再以高分辨图像作为多视角融合的输入,最终得到各向同性的结果。该系统能有效克服大样本的光吸收和散射带来的影响,同时实现各向同性的高分辨三维成像。利用荧光微球测量系统的点扩散函数,可以实现横向和轴向分辨率3-5倍和8-10倍的提升。利用该系统对树脂包埋的透明化脑片,完整的鼠脑,以及琼脂糖包埋的斑马鱼和果蝇进行成像,实现大样品的各向同性的三维高分辨成像。最后,开发了一种基于音圈电机的横轴扫描光片显微镜。产生一个超薄的高斯光片,利用音圈电机驱动物镜将光片沿传播方向扫描。通过控制光片的运动和相机电子狭缝的同步,将光片的瑞利范围拓展为电机的扫描范围。通过利用荧光微球测量,该系统可以在4倍物镜视野下（3.3mm）产生均匀的1.7μm的光片,而常规的1.7μm的光片的瑞利范围只有28μm,此方法将成像视野拓展了近百倍。随后,用该系统对透明化的小鼠脊髓和活体斑马鱼胚胎成像,展示该系统在生物医学上的应用前景。