猪BLM解旋酶基因CDS区的克隆表达与功能分析

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Bloom解旋酶基因(BLM基因)是RecQ解旋酶家族中的重要成员,在细胞DNA的复制、重组、修复、及维持染色体末端稳定性等过程中具有重要作用。人BLM基因突变会使BLM解旋酶活性降低,DNA修复过程受阻,导致染色体不稳定,进而引起Bloom综合征(Bloom syndrome,BS)。BS是一种罕见隐性常染色体遗传疾病,患者易患各种类型癌症。关于畜禽BLM基因与疫病相关性的研究却少有报导。本试验选取从江香猪为研究对象,采用PCR扩增、分子克隆、原核表达、亲和层析和荧光偏振等方法和技术,对猪BLM基因的结构和功能进行研究,为猪重大疾病的发生、发展和防控等方面提供科学依据和新的思路。研究结果如下:(1)运用qRT-PCR技术检测BLM基因在不同病理及猪不同组织中的表达差异,结果显示:以心脏组织为对照,BLM基因在从江香猪各组织中均能检测到表达,其中在睾丸中的相对表达量最高,其次为肺、肝、脾、心、肾、小肠、大肠,在睾丸和肺组织中的表达水平均高于其他组织,为极显著差异(P<0.01)。BLM基因在猪繁殖与呼吸道综合征肺组织、鸡白血病肝组织和鸭瘟肝组织中的表达水平均高于正常组织的表达水平,且均具有显著性差异(P<0.05),暗示BLM基因的变化可能也会导致畜禽疾病的发生。(2)成功克隆猪BLM基因的CDS(Coding sequence)区。测序结果显示,猪BLM基因CDS序列存在4个碱基突变,其中突变引起了第1158位亮氨酸变成了脯氨酸,1362位甘氨酸变成了丝氨酸,其余突变为无义突变。氨基酸序列比对发现,猪BLM基因的氨基酸序列与牛的相似性最高(83.7%)。结构域预测表明猪BLM解旋酶有DEXDc、HELICc、RQC和HEDC这4个结构域。系统进化树分析表明猪BLM基因与牛该基因的亲缘关系最近。(3)构建了pET-32a-BLM673-1301原核表达载体。测序结果显示:猪BLM673-1301序列长度为1884 bp,无碱基突变。蛋白理化性质分析发现,猪BLM673-1301包含628个氨基酸,分子量为71.14 kD,理论的等电点为8.70。(4)利用pET-32a-BLM673-1301成功在体外诱导表达了猪BLM673-1301重组蛋白。猪BLM673-1301解旋酶主要以包涵体形式表达。利用正交试验设计优化猪BLM673-1301解旋酶的可溶性表达,结果显示,20℃、8 h、1 mmol/L IPTG、220 rpm为猪BLM673-1301解旋酶可溶性表达的最佳组合。影响因素,温度>转数>时间>IPTG浓度。方差分析表明,温度、时间、浓度、转速对猪BLM673-1301解旋酶的表达均呈现极显著性(P<0.01)的影响。利用Ni+亲和层析柱纯化猪BLM673-1301解旋酶,最佳洗杂咪唑浓度为100mmol/L,洗脱咪唑浓度为500 mmol/L。纯化后的猪BLM673-1301解旋酶浓度为2.7 g/L,经Westernblot鉴定表达及纯化出来的蛋白为猪BLM673-1301解旋酶。(5)运用荧光偏振仪检测分离纯化后猪BLM673-1301解旋酶的生物学活性。结果显示,纯化出来的猪BLM673-1301解旋酶具有结合活性和解链活性。
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