【摘 要】
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目的:在CHO/dhfr细胞中表达重组人透明带蛋白3(ZP3),进而用ZP3诱导人精子发生顶体反应.为临床诊断一些原因不明的不育不孕症和研制免疫避孕疫苗奠定基础.方法:克隆编码人ZP3
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目的:在CHO/dhfr<->细胞中表达重组人透明带蛋白3(ZP3),进而用ZP3诱导人精子发生顶体反应.为临床诊断一些原因不明的不育不孕症和研制免疫避孕疫苗奠定基础.方法:克隆编码人ZP3的全长的cDNA,构建表达载体pcDNA3.1ZP3.然后,在ZP3基因的下游,插入二氢叶酸还原酶(dhfr)基因,构建表达载体pcDNA3.1ZP3dhfr.采用脂质体法,分别用不带外源基因的pcDNA3.1载体和构建的表达载体pcDNA3.1ZP3dhfr转染CHO/dhfr<->细胞,用Zeocin筛选转染细胞.用MTX提高转染表达载体pcDNA3.1ZP3dhfr的CHO/dhfr<->细胞提高ZP3的表达量.大量培养表达ZP3的CHO/dhfr<->细胞,回收培养液,用Western-blot鉴定重组蛋白,然后将ZP3蛋白浓缩、纯化.最后,测定重组ZP3的活性.取健康男性的精液,用Percoll试剂分离运动良好的精子.在体外条件下使精子获能,随后将精液分成C组(加DMSO),A23187组(加A23187至终浓度为10μm)和ZP3组(加ZP3至终浓度为10ng/μl),分别诱导顶体反应.将各组的精子分别涂片,用考马斯亮蓝G250染色,计数发生顶体反应的精子的百分数.结论:构建的表达载体pcDNA3.1ZP3dhfr转染CHO/dhfr<->细胞后能够分泌ZP3蛋白.并且用MTX诱导后,能够增加转染细胞ZP3蛋白的转录.实验中得到的重组人ZP3蛋白能够诱导精子发生顶体反应,可以用来检测人精子的顶体反应.
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