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背景:无机砷是常见的环境化学污染物,主要存在于地下水、煤矿以及工业废水当中,其中饮用砷污染的地下水是人类慢性砷暴露最主要的途径。肝脏作为无机砷在人体内最主要的代谢场所,是砷最主要的靶器官。大量流行病学研究已经证明,长期砷暴露可以引发肝脏胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）和肝纤维化（Liver fibrosis,LF）等,引发2型糖尿病（type 2 diabetes,T2D）和非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）等多种代谢性疾病。其中,肝脏IR是T2D和NASH等多种疾病的重要病理改变,也是关键起始事件,但是无机砷诱导肝脏IR的分子机制并不明确。本课题组前期研究表明,NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体介导的细胞炎症反应,在无机砷所致肝脏IR中起到了重要的调控作用。但是,无机砷诱导NLRP3转录水平和蛋白水平上调的机制仍不清楚,对炎症小体激活的调控机制仍需进一步探究。核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）转录后修饰对于RNA代谢、蛋白表达以及细胞生理进程的调控具有重要的生物学意义。目前已经发现的RNA转录后修饰方式有百余种,其中N6-methyladenosine（m~6A）修饰是RNA转录后修饰中最常见也是最重要的修饰方式,对RNA的剪接、出核、翻译以及降解过程进行调控,对于疾病的发生发展有着至关重要的作用。研究表明,细胞内m~6A甲基化修饰水平的改变可能与T2D以及NASH的发生发展有着密切的联系。但是在无机砷所致肝脏IR中,m~6A甲基化修饰水平变化情况尚不清楚,另外m~6A甲基化是否在砷致肝脏IR中起到重要的调控作用及其调控机制仍不明确。无机砷在体内主要通过甲基途径进行代谢。砷甲基转移酶（arsenite methyltransferase,AS3MT）是无机砷甲基代谢的关键调节酶,也是第一步限速酶,可以调控无机砷转化为一甲基砷（monomethylarsonic acid,MMA）和二甲基砷（dimethylarsinic acid,DMA）。研究发现,AS3MT可能在无机砷所致IR中起到重要的调控作用,但是具体的调控机制仍不清楚。由于细胞内各类甲基化反应的甲基来源几乎均为S-腺苷甲硫氨酸（s-adenosylmethionine,SAM）,因此无机砷的甲基代谢过程势必会影响到细胞内的m~6A甲基化修饰水平,进而影响细胞的生理进程和疾病的发生发展。因此AS3MT在砷致肝脏IR中的作用机制,以及AS3MT介导的无机砷甲基代谢与m~6A甲基化修饰之间的作用关系值得深入探究。目的:基于以上研究背景,本课题主要研究目的如下:1.m~6A甲基化在无机砷所致肝脏胰岛素抵抗中的作用研究建立砷致早期肝脏胰岛素抵抗小鼠模型,探究无机砷暴露后肝细胞内m~6A甲基化修饰水平的变化,并对相关关键调节酶进行干预后,探究m~6A甲基化修饰在砷致肝脏IR中的作用。2.m~6A甲基化在无机砷诱导NLRP3炎症小体激活中的调控作用研究对小鼠肝脏进行m~6A测序,并对测序结果进行富集分析,寻找m~6A甲基化修饰对砷致肝脏IR影响的可能靶点或通路。对小鼠肝脏中炎症小体激活情况进行检测,探究NLRP3在砷致早期肝脏IR中的作用及其唯一性,并对NLRP3的m~6A甲基化修饰情况进行检测,探讨m~6A甲基化在无机砷诱导NLRP3转录和蛋白水平上调中的作用机制。3.砷甲基转移酶AS3MT在NLRP3 m~6A甲基化中的作用研究对小鼠肝脏中AS3MT的基因和蛋白水平进行检测,对其表达进行干预后,探究其在无机砷诱导的NLRP3炎症小体激活以及肝脏IR中的作用。干预其表达后,探究细胞内m~6A甲基化修饰水平以及NLRP3 m~6A甲基化的变化。方法:1.建立砷致早期肝脏IR小鼠模型选取20只4-6周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机分为对照组和砷暴露组,每组10只。对照组小鼠给予正常饮水和标准饲料,砷暴露组小鼠给予标准饲料以及含砷水（4 mg/L）,其余饲养条件如光照时间,环境温度湿度以及换水时间等均保持一致。每周监测小鼠空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）水平,第六周末对小鼠进行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test,OGTT）以及胰岛素耐量试验（insulin tolerance test,ITT）。检测小鼠空腹血清胰岛素（fasting serum insulin,FSI）水平,计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-IR,HOMA-IR）。处死小鼠后,收集小鼠肝脏和血清样本。用q RT-PCR法检测小鼠肝脏组织中糖异生基因Pck和G6pc的表达情况,用Western blot法对小鼠肝脏组织中胰岛素信号通路相关蛋白的表达情况进行检测。对肝脏组织切片进行苏木素伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色、Masson染色以及油红O（oil red O）染色,检测小鼠肝脏形态学改变、纤维化以及脂质聚集情况。2.砷致肝脏IR小鼠肝脏m~6A甲基化相关检测用Western blot法对小鼠肝脏中m~6A甲基化相关酶的胞浆胞核表达水平进行检测。用ELISA法对小鼠肝脏组织中总RNA以及m RNA的m~6A甲基化含量进行检测。对小鼠肝脏进行m~6A-seq,检测转录组m~6A甲基化修饰差异,并对差异基因进行GO和KEGG富集分析。3.m~6A甲基化在砷致肝脏IR中的作用检测采用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）技术,对人正常肝细胞L-02细胞内m~6A甲基化关键酶METTL14和IGF2BP2的表达进行干预,随后对其进行无机砷（4μM）处理24 h,用胰岛素（100 n M）刺激10 min。采用Western blot法对细胞当中胰岛素信号通路相关蛋白表达进行检测,采用比色法对胰岛素刺激的葡萄糖摄取水平进行检测。4.NLRP3炎症小体在砷致肝脏IR中的作用检测采用Western blot法检测砷致早期肝脏IR小鼠肝脏中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达水平,并采用ELISA法检测小鼠血清当中炎症因子白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）和IL-18的水平。采用免疫荧光法检测砷处理前后L-02细胞当中NLRP3的表达,另外采用Western blot法检测小鼠肝脏当中NLRC4和AIM2的蛋白表达水平。利用NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950（5μM）对L-02细胞进行预处理2 h,随后对其进行无机砷（4μM）处理24 h,用胰岛素（100 n M）刺激10 min。采用Western blot法对细胞当中胰岛素信号通路相关蛋白表达进行检测,采用比色法对胰岛素刺激的葡萄糖摄取水平进行检测。5.m~6A甲基化在无机砷所致NLRP3炎症小体激活中的作用检测采用si RNA技术对L-02细胞内m~6A甲基化关键酶METTL14和IGF2BP2的表达进行干预,随后对其进行无机砷（4μM）处理24 h。采用Western blot法对NLRP3炎症小体相关蛋白表达进行检测,采用ELISA法对培养上清中IL-1β及IL-18的水平进行检测。采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）法检测METTL14和IGF2BP2与NLRP3之间的互作情况。另外,利用放线菌素D（actinomycin D,Act D）对细胞分别处理0、3、6 h后,采用q RT-PCR法对NLRP3的基因表达水平进行检测。6.AS3MT在砷致肝脏IR中的作用及其对m~6A甲基化修饰影响的检测采用q RT-PCR法对砷致早期肝脏IR小鼠肝脏中以及砷处理L-02细胞中AS3MT的基因表达水平进行检测,采用Western blot法以及免疫组化法（immunohistochemistry,IHC）对AS3MT的蛋白表达水平进行检测。采用si RNA技术对L-02细胞内AS3MT的表达进行敲减,随后对其进行无机砷（4μM）处理24 h,用胰岛素（100 n M）刺激10 min。采用Western blot法对细胞当中胰岛素信号通路相关蛋白表达进行检测,采用比色法对胰岛素刺激的葡萄糖摄取水平进行检测。另外,采用Western blot法检测L-02细胞中m~6A甲基化相关酶胞浆胞核表达水平,采用ELISA法检测细胞内总RNA及m RNA中m~6A甲基化含量变化。7.AS3MT与NLRP3互作情况及其对NLRP3 m~6A甲基化影响的检测采用siRNA技术对L-02细胞内AS3MT的表达进行敲减,或利用MCC950对细胞进行预处理2 h,随后对细胞进行无机砷（4μM）处理24 h,采用Western blot法检测细胞内AS3MT及NLRP3炎症小体相关蛋白的表达水平。采用Co-IP法对小鼠肝脏组织中以及L-02中内源表达的AS3MT与NLRP3的互作情况进行检测,并根据人源的AS3MT和NLRP3氨基酸序列与功能域,设计一系列截短质粒,利用人胚胎肾细胞HEK293T细胞进行转染,采用Co-IP法对二者互作区域进行检测。另外,采用si RNA技术对L-02细胞内AS3MT的表达进行敲减,采用Co-IP法检测m~6A甲基化关键酶与NLRP3互作情况;利用Act D分别对细胞进行处理0、3、6 h,提取RNA,采用q RT-PCR法对NLRP3的基因表达水平进行检测。8.统计学分析采用SPSS 26软件进行数据分析处理。计量资料数据均采用均数±标准误（"±SEM）进行统计分析,两组比较采用双尾t检验,多组比较采用单因素方差分析进行两两比较。P＜0.05认为差异具有统计学意义。结果:1.m~6A甲基化在无机砷所致肝脏胰岛素抵抗中的作用研究1.1与对照组小鼠相比,暴露组小鼠FBG及FSI水平显著上调,HOMA-IR指数升高;暴露组小鼠葡萄糖耐量及胰岛素耐量明显受损,肝脏糖异生基因Pck及G6pc表达水平上调,胰岛素信号相关蛋白磷酸化水平降低。但是两组小鼠间体重及脏器系数均无明显差异,暴露组小鼠肝脏也未发现明显病变,说明砷致早期肝脏IR模型建立成功。1.2 Western blot结果表明,与对照组小鼠相比,暴露组小鼠肝脏中m~6A甲基化关键酶METTL14及IGF2BP2在胞核内的表达水平显著升高;m~6A-seq结果发现,与对照组相比,暴露组小鼠肝脏当中m~6A甲基化总体水平上调;ELISA结果进一步证实,暴露组小鼠肝脏中总RNA及m RNA的m~6A甲基化含量显著高于对照组。1.3与体内结果相一致,无机砷暴露后,L-02细胞中胰岛素信号通路相关蛋白磷酸化水平降低,胰岛素刺激的葡萄糖摄取能力降低。对m~6A甲基化关键酶METTL14及IGF2BP2进行敲减后,无机砷诱导的L-02细胞胰岛素敏感性降低得到了明显改善。2.m~6A甲基化在无机砷诱导NLRP3炎症小体激活中的调控作用研究2.1 Western blot结果表明,在砷致早期肝脏IR过程中存在NLRP3炎症小体的激活。利用MCC950特异性抑制NLRP3炎症小体后,可以显著改善无机砷诱导的L-02细胞敏感性降低。并且无机砷特异调控NLRP3炎症小体,而非其他炎症小体。2.2对m~6A-seq结果进行富集分析发现,m~6A甲基化可以调控NLRP3相关信号通路。Co-IP结果发现,与对照组相比,暴露组小鼠肝脏组织当中m~6A甲基化关键酶METTL14及IGF2BP2与NLRP3之间存在明显的互作情况。另外,对L-02进行无机砷处理24 h,利用Act D对细胞进行处理0、3、6 h后,对NLRP3基因表达水平进行检测发现,与砷暴露组相比,NLRP3 m RNA的半衰期明显缩短,NLRP3 m RNA稳定性降低。2.3与对照组相比,无机砷处理后L-02细胞中NLRP3炎症小体激活,细胞培养上清中炎症因子IL-1β及IL-18的水平显著升高。而对m~6A甲基化关键酶METTL14及IGF2BP2进行敲减后,可以显著抑制无机砷诱导的NLRP3炎症小体激活,细胞培养上清中炎症因子IL-1β及IL-18的水平显著降低。3.砷甲基转移酶AS3MT在NLRP3 m~6A甲基化中的作用研究3.1 Western blot结果表明,无机砷暴露后,小鼠肝脏组织及L-02细胞中AS3MT的蛋白表达水平显著上调,并且IHC结果发现砷暴露后小鼠肝脏组织中AS3MT水平升高;同时q RT-PCR结果发现,砷暴露后小鼠肝脏组织当中AS3MT基因表达水平也显著上调;另外,对L-02细胞内AS3MT进行敲减后,可以显著改善无机砷诱导的胰岛素敏感性降低。3.2对AS3MT进行敲减后,可以显著抑制无机砷诱导的NLRP3炎症小体激活,而利用MCC950抑制NLRP3炎症小体后,并不能降低无机砷诱导的AS3MT的表达;Co-IP结果表明,无机砷暴露后可以促进AS3MT与NLRP3的相互作用,并且截短Co-IP结果表明,AS3MT 201-375段与NLRP3 211-550段是最有可能的互作区域。3.3与体内结果相一致,无机砷暴露后,m~6A甲基化关键酶METTL14及IGF2BP2的胞核表达水平显著上调。对AS3MT进行敲减后,显著抑制METTL14及IGF2BP2在胞核内的表达;另外,ELISA结果发现,无机砷暴露可以上调L-02细胞内总RNA及m RNA中m~6A甲基化含量,而对AS3MT进行敲减后,L-02细胞内总RNA及m RNA中m~6A甲基化含量显著降低。3.4 Co-IP结果表明,对AS3MT进行敲减后显著抑制m~6A甲基化关键酶METTL14及IGF2BP2与NLRP3之间的互作水平。另外,RNA稳定性试验发现,对AS3MT进行敲减后NLRP3 m RNA半衰期明显缩短。结论:1.在无机砷所致早期肝脏IR当中,m~6A甲基化修饰水平上调,并促进肝脏IR的发生。2.无机砷所致早期肝脏IR依赖于NLRP3炎症小体,并且m~6A甲基化参与无机砷诱导的NLRP3表达以及炎症小体激活过程。3.AS3MT可能通过调控NLRP3 m~6A甲基化修饰调控NLRP3的表达及炎症小体的激活,促进无机砷所致早期肝脏IR的发生。