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研究背景胰腺癌恶性程度高,进展快,目前是西方国家第4位致死肿瘤,在我国的发病率也逐年上升。85%的胰腺癌患者在就诊时已丧失手术机会,其预后差,中位生存时间不足6个月,5年生存率为0.4-5%。以化疗为核心的辅助治疗成为胰腺癌治疗的关键,目前在胰腺癌术后辅助化疗方面5-FU与健择是主要的选择药物,尽管近年来新的化疗药和改进的联合化疗方案不断推出,但化疗效果并不理想,而化疗个体化可能是提高临床疗效的有效途径之一。化疗个体化治疗首先要解决的是肿瘤药物敏感性的问题,近年来随着对人类个体基因差异的深入理解,发现基因多态性与肿瘤化疗密切相关,胸苷酸合成酶(Thymidylate Synthase, TS)是嘧啶再合成及5FU代谢过程中的关键酶,目前研究表明TS基因存在多态性,而不同基因型其表达可能存在差异,从而影响肿瘤患者的临床疗效,因此目前TS基因多态性与化疗疗效的相互关系引起了越来越多学者的重视。胶原凝胶微滴肿瘤药敏检测技术(collagen gel droplet culture drug-sensitivity test, CD-DST)是一种新的肿瘤体外药敏检测技术31,既往研究选用的胰腺癌体外药物敏感性检测多为体外二维单层培养的细胞模型,但是由于人体内的胰腺癌组织是一个三维细胞群体,肿瘤本身作为一个整体而具有与其单个肿瘤细胞不同的特性,肿瘤细胞之间不但相互作用和影响而且肿瘤细胞受到所处的微环境的影响,而体外二维单层培养的细胞模型不能很好的模拟体内环境,CD-DST技术使细胞在凝固的鼠尾Ⅰ型胶原里生长,细胞分裂成细胞团,肿瘤细胞生长状态更加接近生理,从而使药敏结果更加真实可信。研究目的拟通过对多株胰腺癌细胞株、临床胰腺癌患者外周血淋巴细胞、患者术后原代培养的胰腺癌细胞、病理组织及接受5-FU化疗患者疗效随访等多方面研究,分析胸苷酸合成酶(Thymidylate Synthase,TS)基因多态性与5-FU化疗敏感性的关系,研究不同基因型胰腺癌细胞对5-FU化疗效果的差异,探索可靠的胰腺癌化疗预测指标,从而为胰腺癌的个体化治疗提供新途径。研究方法提取胰腺癌患者外周血及7株人胰腺癌细胞DNA后,TS基因增强子区(TS enhancer region, TSER)存在28bp串联重复序列多态性使用PCR扩增TS目的DNA片段,直接测序检测目的片段序列,毛细管电泳结果使用GENEMARKER软件分析基因型。TS基因SNP位点检测采用直接测序法,DNAMAN软件比对测序结果,对样本DNA的SNP位点进行基因分型。使用real-time PCR检测人胰腺癌细胞株中不同基因型细胞TS mRNA表达差异,使用Western Blotting检测其TS蛋白表达水平。利用CCK-8试剂盒检测7株胰腺癌细胞对5-FU的化疗敏感性,临床胰腺癌标本的体外药敏检测通过鼠尾胶原建立以三维培养为平台的胶原凝胶微滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)检测。胰腺癌患者癌组织TS蛋白表达检测使用免疫组化法并且对于接受5-FU化疗患者进行随访。数据统计应用SPSS 11.0软件对正态分布的计量资料进行单因素方差分析,患者生存率评估使用kaplan-Meier分析,当p值小于0.05认为具有显著的统计学差异。结果1.TS基因多态性检测结果：发现TS基因增强子区(TS enhancer region, TSER)存在28bp串联重复序列多态性,28 bp串联重复序列有2次重复(2R)与3次重复(3R)。根据重复次数不同基因型可分为2R/2R、2R/3R、3R/3R三种,其中人胰腺癌细胞基因型为2R/2R:T3M4与BxPC-3;2R/3R:ASPC-1,Capan-1与SU86.86; 3R/3R:PANC-1与COL0357.2.31例胰腺癌患者中TS基因型2R/2R为48.4%(15例),2R/3R为22.6%(7例),3R/3R为29.0%(9例)。3. RT-PCR结果表明：人胰腺癌细胞不同基因型TS基因mRNA表达存在差异,3R/3R基因细胞TS mRNA表达高于其它基因型,但差异无统计学意义(P>0.05)。4. Western Blotting结果表明：细胞株AsPC-1, BxPC-3,Capan-1, SU86.86, T3M4中TS蛋白表达水平低(低TS表达组),而PANC-1与COL0357中TS蛋白表达水平较高(高TS表达组),低TS表达组TS基因型为2R/2R与2R/3R,高TS表达组基因型为3R/3R。基因型2R/2R,2R/3R与3R/3R光密度值分别为0.568±0.032,0.561±0.056与1.393±0.374,差异有统计学意义(P<0.05)5.CCK-8结果表明：基因型为2R/2R的细胞在低中高3个不同药物浓度下对5-FU抑制率分别为0.811±0.090,0.880±0.067和0.922±0.038；基因型为2R/3R的细胞对5-FU抑制率分别为0.595±0.065,0.695±0.070和0.780±0.075；同浓度下基因型为3R/3R的细胞对5-FU抑制率分别为0.370±0.157,0.548±0.018与0.638±0.020。不同药物浓度下基因型为3R/3R的细胞对5-FU的药物抑制率均明显低于其他组,差异均有统计学意义(P<0.05)6.细胞凋亡检测：通过Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡结果发现不同基因型细胞加入5-FU作用72h后,2R/2R(BxPC-3)基因型细胞的凋亡率显著高于3R/3R(COL0357)及2R/2R(ASPC-1)基因型细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。7. CD-DST结果显示：3R/3R(P1)基因型的患者胰腺癌细胞抑制率为24.93±4.88。2R/2R(P2,P3,P4)基因型的患者胰腺癌细胞抑制率分别是40.70±3.33,35.95±3.94,47.94±4.38。3R/3R基因型的胰腺癌患者抑制率著低于2R/2R基因型,差异均有统计学意义(P<0.05)。8.免疫组化结果显示：TS蛋白表达水平与患者的年龄,性别,手术切缘,肿瘤大小肿瘤组织类型,TNM分期,有无淋巴结转移以及有无其他组织或脏器转移均无关(P>0.05)。胰腺癌组织中TS蛋白表达与患者病理分型及基因型密切相关,在胰腺癌组织中2R/2R、2R/3R基因型TS蛋白表达阳性率为40.9%(9/22),3R/3R基因型TS蛋白表达阳性率为88.9%(8/9),3R/3R基因型TS蛋白阳性表达率明显高于2R/2R及2R/3R基因型(P=0.021)。TS蛋白在不同病理分级病人中的阳性表达情况有所差别,在胰腺癌低分化组TS蛋白表达阳性率为90.9%(10/11),中高分化组TS蛋白表达阳性率为35.0%(7/20),低分化组TS蛋白表达阳性率明显高于中高分化组(P=0.007)。9.胰腺癌患者实施接受以5-FU为基础的化疗后持续随访,结果发现3R/3R基因型患者生存率(Overall survival, OS)比2R/2R或2R/3R基因型患者更低(p=0.007),而无瘤生存率(progression-free survival, PFS)在3R/3R基因型患者与2R/2R或2R/3R基因型患者之间同样存在显著差别,3R/3R基因型患者PFS更低(p=0.035)。生存曲线显示TS蛋白表达阴性组患者预后相对较好,无论是OS还是PFS都比TS蛋白阳性表达组高,差异有统计学意义OS(P<0.05) PFS(P=0.001), TS的表达水平与患者的预后呈负相关。结论1.本实验通过检测人胰腺癌细胞株TS基因5’UTR多态性,结果发现不同的癌细胞TS基因型有差别,且在被测胰腺癌患者中TS基因型分布2R/2R纯合基因型患者比例最高,其次为3R/3R及2R/3R基因型患者。2.人胰腺癌细胞中TS不同基因型与其蛋白表达水平密切相关,3R/3R基因型细胞TS蛋白表达水平较高,免疫组化结果同样提示3R/3R基因型患者胰腺癌组织中TS蛋白表达水平较高。3.人胰腺癌细胞株使用cck-8法进行的5-FU体外化疗敏感性检测及4名胰腺癌患者使用CD-DST进行的5-FU体外化疗敏感性检测均显示TS基因多态性与5-FU化疗敏感性密切相关,胰腺癌3R/3R基因型细胞比2R/2R与2R/3R基因型细胞对5-FU化疗敏感性更低。4.人胰腺癌细胞中TS蛋白表达水平与体外细胞对5-FU的化疗敏感性密切相关,TS蛋白高表达的胰腺癌细胞5-FU的抑制率低。5.TS基因型与胰腺癌患者化疗预后密切相关,接受以5-FU为基础的化疗后,3R/3R基因型患者预后更差,胰腺癌组织中TS蛋白表达水平与患者的预后呈负相关,癌组织中TS蛋白高表达患者接受以5-FU为基础的化疗预后较差,但TS基因型是否可以作为评估以5-FU为基础的化疗药物对胰腺癌化疗效果及判断预后的分子指标还有待更大样本的临床研究证实。